前段時間，經(jīng)歷了幾個月的時間，為實驗室建了一個細胞培養(yǎng)間。目前這個細胞培養(yǎng)間運轉(zhuǎn)良好，培養(yǎng)的神經(jīng)元長了10來天，長勢不錯，已經(jīng)可以認為細胞培養(yǎng)室建立成功。在建立細胞培養(yǎng)間的過程中，碰到了許多問題，逐一解決后，覺得大家如果要建立細胞培養(yǎng)間，肯定也會碰到許多相同的問題，所以將我碰到的問題整理出來。首先向大家推薦一本書，個人認為是比較經(jīng)典的——《動物細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)指南》科學(xué)出版社，英，R.I.弗雷謝尼。內(nèi)容不多，但以下的資料大部分是書上找不到的。

2005-4-30

陸新江

一、建細胞間的一些細節(jié)問題：

1、甲醛薰蒸：

資料（internet）：

40％甲醛溶液(藥用規(guī)格、福建三明化工總廠出品)，用量30 ml／m3，室內(nèi)溫度21～24℃，相對濕度75％～85％，加熱薰蒸使蒸汽彌漫全室，關(guān)閉門窗1 h。

甲醛水溶液為無色，具有強烈刺激性氣味的液體，可殺滅多數(shù)微生物，價廉，熏蒸消毒時不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛。其主要用法為：
1．熏蒸消毒:　對室內(nèi)消毒其用量為20－25%毫升/米，在加熱該溶液時最好同時煮沸一壺水，使室內(nèi)相對溫度保持在70-90%左右，室內(nèi)溫度最好在20攝氏度以上，作用時間12-24小時。如消毒皮毛服裝，甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,掛衣密度為每平方米3套為宜。熏蒸消毒時應(yīng)密閉門窗。消毒后一般多用自然通風(fēng)驅(qū)散甲醛氣體，其需時較長，急于排出氣體，可將25%氨水加熱蒸發(fā)中和。氨水用量為所用甲醛水溶液的一半，中和時間為30分鐘。
2．自然揮發(fā): 將較大量的甲醛水溶液放入一敞開容器中，室內(nèi)溫度保持在18攝氏度以上，同時室內(nèi)噴水以保持相對濕度在70%以上，經(jīng)16小時可達到室內(nèi)消毒的目的。

關(guān)于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比較：甲酸的毒性比甲醇大6倍，甲醛的毒性比甲醇大30倍。所以吃進4~10克甲醇，就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表現(xiàn)在損傷視力，使視力減退（不能矯正），視野縮小，以致雙目失明，直到死亡。

實際操作：

我的每個房間是7個平方，約20個立方。按書上的算要福爾馬林300ml，高錳酸鉀100g。

高錳酸鉀放入甲醛液體中后，在開始的3秒鐘內(nèi)沒有反映，3秒鐘以后，會產(chǎn)生大量煙氣。所以一旦在甲醛中加了高錳酸鉀請馬上離開滅菌室，并關(guān)上門。

高錳酸鉀放入甲醛液體中會使液體沸騰，所以反應(yīng)要在比較大的大口徑容器進行，本人用的是臉盆。

甲醛氣體毒性非常強，所以操作時一定要帶上防毒面具。

2、關(guān)于紫外線：

資料：

紫外線的穿透能力非常弱的，主要靠電離產(chǎn)生氧自由基來消毒。細胞培養(yǎng)室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料蓋住。如：玻璃和有機玻璃都可以的。紫外有些人認為大型精密的顯微鏡是不可以照紫外的，因為它們的鏡頭上涂的膜會被分解掉，但我特意問了我校光學(xué)系的老師，他們認為是沒有關(guān)系的。

紫外線在許多實驗室被認為是起心理安慰作用的。我參觀過的一個細胞培養(yǎng)間他們的房間大約6平方米，但是只裝了30W的紫外燈，但前提是他們有一個層流系統(tǒng)。

個人認為，如果細胞培養(yǎng)間有層流系統(tǒng)，那紫外的作用是可以被忽略的，但如果沒有層流系統(tǒng)，那么紫外的作用還是相當(dāng)重要。

此外，不要擔(dān)心紫外不能照射到的角落，因為紫外殺菌功能除了紫外本身以外，還可以由產(chǎn)生的臭氧來完成。

臭氧過量吸入的作用應(yīng)該和雙氧水的作用是一樣的，個人認為也許有一定的致癌性。所以紫外滅菌以后，最好過一個小時再進去。

3、關(guān)于新潔爾滅：

資料：

【藥品名稱】苯扎溴銨溶液 (新潔而滅溶液) (乙類非處方藥【別 名】BenzalkoniumBromideSolution【標(biāo)準來源】《中華人民共和國藥典》2000年版�！拘� 狀】 無色或淡黃色的澄明液體;芳香;味極苦;強力振搖能發(fā)生多量泡沫，遇低溫可能發(fā)生渾濁或沉淀。【藥物組成】每毫升含苯扎溴銨0.05克 (5%)�！咀饔妙悇e】皮膚科用藥品。【藥理作用】苯扎溴銨為陽離子表面活性劑類廣譜殺菌劑�！九R床應(yīng)用】用于皮膚黏膜和傷口的消毒�！居梅ㄓ昧俊� 外用，使用前應(yīng)稀釋即配即用。皮膚消毒使用0.1%溶液；創(chuàng)面黏膜消毒用0.01%溶液； 稀釋方法：0.1%溶液：取本品一份，加純化水或清水50份；0.01%溶液：取本品1份，加純化水或清水500份�！咀⒁馐马棥� l. 本品為外用消毒防腐藥，不可內(nèi)服。2. 不得用塑料或鋁制容器貯存。3. 涂布部位如有灼燒感、瘙癢、紅腫等，應(yīng)停止用藥，洗凈。必要時向醫(yī)師咨詢。4. 低溫時，可能出現(xiàn)混濁或沉淀，可置于溫水中加溫，振搖使溶解后使用。5. 兒童必須在成人監(jiān)護下使用�！静涣挤磻�(yīng)】偶見過敏反應(yīng)。 【藥物相互作用】 l. 不得與肥皂或其他合成洗滌劑并用。2. 局部消毒時勿與碘酊、高錳酸鉀、雙氧水、磺胺粉等并用。 3. 如正在使用其他藥品，使用本品前請咨詢醫(yī)師或藥師�！疽�(guī) 格】500毫升﹕25克；100毫升﹕5克(5%)�！举A 藏】避光，密封保存。

評論：在甲醛滅菌前，先用新潔爾來擦洗整個墻面，此外，平時地板滅菌也可以用它。新潔爾滅和酒精相比，最大的優(yōu)點是便宜，因為新潔爾滅500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。

二、培養(yǎng)準備時的一些問題：

1、多聚賴氨酸：

資料：多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） 　

Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃
Thimerosal, 0.01%, added as preservative

多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強的黏合力。
適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實驗操作過程中組織掉片。也可用于細胞培養(yǎng)，增加細胞貼壁能力。

[使用說明]
免疫學(xué)
操作步驟（可直接在玻片上涂布）
1． 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。
2． 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-26℃
3． 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。
4．在60℃烘箱1小時干燥，或室溫18-26℃過夜干燥待用。

[注意]
1． 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子將影響其黏合力。
2． 用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。
3． 不要在用過的稀釋液中加新的溶液。
4． 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3個月內(nèi)是穩(wěn)定的。
5． 用過的稀釋液要過濾，若出現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。

2、洗液的一些問題：

資料：

重鉻酸鉀硫酸洗液
　　通常稱為洗潔液或洗液，其成分主要為重鉻酸鉀與硫酸,是強氧化劑。
　　K2Cr2O7 4H2SO4 K2SO4 Cr2(SO4)3 3[O]
　　因其有很強的氧化力，一般有機物如血、尿、油脂等類污遺跡可被氧化而除凈。事先將溶液稍微加熱，則效力更強。新鮮鉻酸洗液為棕紅色，若使用的次數(shù)過多，重鉻酸鉀就被還原為綠色的鉻酸鹽，效力減小，此時可加熱濃縮或補加重鉻酸鉀，仍可繼續(xù)使用。
　　配方：稀洗液 重鉻酸鉀 10g
粗濃硫酸 200ml
水 100ml
　　　　　濃洗液 重鉻酸鉀 20g
粗濃硫酸 350ml
水 40ml
　　配法：先取粗制重鉻酸鉀20g，放于大燒杯內(nèi)，加普通水100ml使重鉻酸鉀溶解（必要時可加熱溶解）。再將粗制濃硫酸（200ml）緩緩沿邊緣加入上述重鉻酸鉀溶液中即成。加濃硫酸時須用玻璃棒不斷攪拌，并注意防止液體外溢。若用瓷桶大量配制，注意瓷桶內(nèi)面必須沒有掉瓷，以免強酸燒壞瓷桶。配時切記，不能把水加于硫酸內(nèi)（將因硫酸遇水瞬間產(chǎn)生大量的熱量使水沸騰，體積膨脹而發(fā)生爆濺）。
　　使用時先將玻皿用肥皂水洗刷1～2次,再用清水沖凈倒干,然后放入洗液中浸泡約2小時,有時還需加熱,提高清潔效率。經(jīng)洗液浸泡的玻皿，可先用自來水沖洗多次，然后再用蒸餾水沖洗1～2次即可。
　　附有蛋白質(zhì)類或血液較多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固，更不可對有如酒精、乙醚的容器用洗液洗滌。
　　洗液對皮膚、衣物等均有腐蝕作用，故應(yīng)妥善保存。使用時帶保護手套。為防止吸收空氣中的水分而變質(zhì)，洗液貯存時應(yīng)加蓋。

注意：

洗液具有強烈的腐蝕性，接觸皮膚后會，皮膚會變黃，2天后會脫一層皮。

3、氟尿嘧啶：

別 名：5?氟尿嘧啶 英 文 名：Fluorouracil (5 FU)。作用與用途：本品為嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷核，干擾DNA合成。對RNA的合成也有一定的抑制作用。

操作：在神經(jīng)元培養(yǎng)時可以用來抑制膠質(zhì)的生長。

4、L-谷氨酰氨：

資料：

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位.不同種類的細胞對氨基酸的要求各異,但有幾種氨
基酸細胞自身不能合成,必須依靠培養(yǎng)液提供,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸.其中谷氨
酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡.
因此,各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,應(yīng)
置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi).已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲
存2周以上時,還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺.

三、海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的方法：

操作步驟：

1．取 2ml 左右的L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml） 包被培養(yǎng)板或coverlip；

2. 將出生小于24h的乳鼠6-8個用70%乙醇消毒，逐個斷頭，取腦，放入冰浴的解剖液中；

3. 用彎頭鑷鑷取海馬和皮層，去除腦膜和血管，分別放入干凈的平皿中，用手術(shù)刀片分別將海馬和皮層切細。

4. 將組織塊置于15ml解剖液配制的0.25%胰蛋白酶中，37ºC，靜置20min，取出時，勿搖晃。

5. 吸棄去上層胰酶液，下層組織沉淀約2ml, 加3ml種植液沖洗一遍。靜置約3分鐘。

6. 吸棄去上層液體，下層組織沉淀約2ml, 加3ml種植液沖洗一遍。離心800rpm×1min

7. 吸棄去上層液體，加2ml種植液

8. 用一根吸管，頭燒細，冷卻，輕輕吹打約15-20次，制成細胞懸液。

9. 取50ul細胞懸液稀釋到1ml, 計數(shù)4大格。

10. 細胞濃度=4大格細胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104/ml

11. 例如120/4×20×104/ml=6×106/ml

12. 按照0.6--2×106/ml的密度接種神經(jīng)元。

13. 24h后全量換液成飼養(yǎng)液

14. 每三天用Neuronbasal使用液半量換液。

15. 接種后3-5天，加阿糖胞苷至終濃度10uM作用48小時，抑制膠質(zhì)細胞的過度生長。

注意事項

1 用L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml） 包被培養(yǎng)板后，要待其干后才能接種，因為其對神經(jīng)元有毒性。L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。

2 取腦組織時動作盡量要快，并且盡量低溫操作。

3 分離皮層和海馬時，要盡量分離腦膜和血管，否則有大量的成纖維細胞。

4 用吸管輕輕吹打細胞時，盡量不起泡沫，以免損傷神經(jīng)元。

5 接種細胞的過程，動作要快，以免細胞聚集。

6 接種細胞后，24h勿移動，以免影響細胞貼壁。

四 結(jié)果：

大多數(shù)神經(jīng)元在接種1h內(nèi)貼壁，3-5h開始變平，并長出1-2個突起。3天后，許多細胞從胞體長出數(shù)個突起。神經(jīng)元在7-10天開始成熟，胞體逐漸長至30-40um,暈光明顯，胞核和核仁清晰可見，突起變粗，變長并且有分支，邊緣清楚，發(fā)亮，形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元可存活1-2月。