1.1微生物生長的概念
一個微生物細胞在合適的外界環(huán)境條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按其自身的代謝方式進行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量、體積、大�。┚筒粩嘣黾�，于是出現(xiàn)了個體的生長現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長，即各細胞組分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，從而引起個體數(shù)目的增加，這時，原有的個體已經(jīng)發(fā)展成一個群體。隨著群體中各個個體的進一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其重量、體積、密度或濃度作指標來衡量。所以：
個體生長→個體繁殖→群體生長
群體生長＝個體生長＋個體繁殖
這里需要強調(diào)的是，上述微生物生長的階段性，對于單細胞微生物來說是不明顯的，往往在個體生長的同時，伴隨著個體的繁殖，這一特點，在細菌快速生長階段尤為突出，有時在一個細胞中出現(xiàn)2或4個細胞核；除了特定的目的以外，在微生物的研究和應用中，只有群體的生長才有實際意義，因此，在微生物學中提到的“生長”，均指群體生長。這一點與研究高等生物時有所不同。
微生物的生長繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映，因此，生長繁殖情況就可作為研究各種生理、生化和遺傳等問題的重要指標；同時，微生物在生產(chǎn)實踐上的各種應用或是對致病、霉腐微生物的防治，也都與它們的生長繁殖和抑制緊密相關。下面對微生物的生長繁殖及其控制的規(guī)律作較詳細的介紹。
1.2微生物生長量的測定
既然生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定生長的方法也都直接地以此為根據(jù)，而測定繁殖則都要建立在計數(shù)這一基礎上。
1.2.1 稀釋平板菌落計數(shù)法
是一種最常用的活菌計數(shù)法。取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在其凝固前均勻混合，或涂布于已凝固的固體培養(yǎng)基平板上。在最適條件下培養(yǎng)后，從平板上（內(nèi)）出現(xiàn)的菌落數(shù)乘上菌液的稀釋度，即可計算出原菌液的含菌數(shù)。在一個9cm直徑的培養(yǎng)皿平板上，一般以出現(xiàn)50～500個菌落為宜。
這種方法在操作時，有較高的技術要求。其中最重要的是應使樣品充分混勻，并讓每支移液管只能接觸一個稀釋度的菌液。有人認為，對原菌液濃度為109個/mL的微生物來說，如果第一次稀釋即采用10-4級（用10μL菌液至100mL無菌水中），第二次采用10-2級（吸1mL上述稀釋液至100mL無菌水中），然后再吸此菌液0.2mL進行表面涂布和菌落計數(shù)，則所得的結(jié)果最為精確。其主要原因是，一般的吸管壁常因存在油脂而影響計數(shù)的精確度（有時誤差竟高達15％）。這一稀釋過程的示意圖詳見實驗技術。
1.2.2 血球計數(shù)板法
是用來測定一定容積中的細胞總數(shù)目的常規(guī)方法（詳見第十章實驗五）。這種方法的特點是測定簡便、直接、快速，但測定的對象有一定的局限性，只適合于個體較大的微生物種類，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外測定結(jié)果是微生物個體的總數(shù)，其中包括死亡的個體和存活的個體，要想測定活菌的個數(shù)，還必須借助其它方法配合。
1.2.3 稱干重
可用離心法或過濾法測定，一般干重為濕重的10%～20%。在離心法中，將待測培養(yǎng)液放入離心管中，用清水離心洗滌1～5次后，進行干燥。干燥溫度可采用105℃、100℃或紅外線烘干，也可在較低的溫度（80℃或40℃）下進行真空干燥，然后稱干重。以細菌為例，一個細胞一般重約10-12～10-13g。
另一種方法為過濾法。絲狀真菌可用濾紙過濾，而細菌則可用醋酸纖維膜等濾膜進行過濾。過濾后，細胞可用少量水洗滌，然后在40℃下真空干燥，稱干重。以大腸桿菌為例，在液體培養(yǎng)物中，細胞的濃度可達2×108個/mL。100mL培養(yǎng)物可得10～90mg干重的細胞。
這種方法較適合于絲狀微生物的生長量的測定，對于細菌來說，一般在實驗室或生產(chǎn)實踐中較少使用。
1.2.4 比濁法
細菌培養(yǎng)物在其生長過程中，由于原生質(zhì)含量的增加，會引起培養(yǎng)物混濁度的增高。最古老的比濁法是采用MoFarland比濁管。這是用不同濃度的BaCl2與稀H2SO4配制成的10支試管，其中形成的BaSO4有10個梯度，分別代表10個相對的細菌濃度（預先用相應的細菌測定）。某一未知濃度的菌液只要在透射光下用肉眼與某一比濁管進行比較，如果兩者透光度相當，即可目測出該菌液的大致濃度。
如果要作精確測定，則可用分光光度計進行。在可見光的450～650nm波段內(nèi)均可測定。為了對某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時跟蹤，可采用不必取樣的側(cè)壁三角燒瓶來進行。測定時，只要把瓶內(nèi)的培養(yǎng)液倒入側(cè)臂管中，然后將此管插入特制的光電比色計比色座孔中，即可隨時測出生長情況，而不必取用菌液（圖5-1）。
圖5-1 測定生長用的側(cè)臂三角燒瓶
1. 側(cè)臂試管三角燒瓶；2. 側(cè)臂試管；3. 側(cè)臂試管插座；4. 比色架面板；
5. 連接螺絲；6. 比濁測定透光窗；7. 光路開關孔；8. 比色架底板
以上介紹了若干測定微生物的生長量或計算繁殖數(shù)的主要方法。其中，最常用的為稱干重、測濁度（用分光光度計）用計數(shù)板測總菌數(shù)以及用平板菌落計數(shù)法測活菌數(shù)等方法。必須指出的是，不管用什么方法，都有其優(yōu)缺點和使用范圍。所以，在使用前，一定要根據(jù)自己的研究對象和研究目的的不同，選用最合適的方法。
1.3 微生物的群體生長規(guī)律
單細胞的微生物，如細菌、酵母菌在液體培養(yǎng)基中，可以均勻地分布，每個細胞接觸的環(huán)境條件相同，都有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，故每個細胞都迅速地生長繁殖。霉菌多數(shù)是多細胞微生物，菌體呈絲狀，在液體培養(yǎng)基中生長繁殖的情況與單細胞微生物不一樣，如果采取搖床培養(yǎng)，則霉菌在液體培養(yǎng)中的生長繁殖情況，近似于單細胞微生物。因液體被攪動，菌絲處于分布比較均勻的狀態(tài)，而且菌絲在生長繁殖過程中不會象在固體培養(yǎng)基上那樣有分化現(xiàn)象，孢子產(chǎn)生也較少。
1.3.1典型的生長曲線
微生物生長繁殖的速度非�？欤话慵毦谶m宜的條件下，大約20~30分鐘就可以分裂一次，如果不斷迅速地分裂，短時間內(nèi)可達驚人的數(shù)目，但實際上是不可能的。在培養(yǎng)條件保持穩(wěn)定的狀況下，定時取樣測定培養(yǎng)液中微生物的菌體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的開始階段，菌體數(shù)目并不增加，一定時間后，菌體數(shù)目就增長很快，繼而菌體數(shù)目增長速度保持穩(wěn)定，最后增長速度逐漸下降以致等于零。如果以培養(yǎng)時間為橫坐標，以以活菌數(shù)的對數(shù)值作縱坐標，就可作出一條生長曲線。這生長曲線（growth curve）代表單細胞微生物從生長開始到衰老死亡的一般規(guī)律。
根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growth rate constant），即每小時的分裂代數(shù)的不同，一般把典型的生長曲線粗分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個時期。見圖4-1：
⑴ 延滯期（lag phase）
又叫適應期、緩慢期或調(diào)整期，是指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液剛開始的一段時間細胞數(shù)目不增加的時期，甚至細胞數(shù)目還可能減少。延滯期有如下特點：1）生長的速率常數(shù)為零。2）細胞的體積增大，DNA、含量增多為分裂作準備。3）合成代謝旺盛，核糖體、酶類和的合成加快，易產(chǎn)生誘導酶。4）對不良環(huán)境敏感，例如pH、Nacl溶液濃度、溫度和抗生素等化學物質(zhì)。
延滯期出現(xiàn)的原因，可能是為了重新調(diào)整代謝。當細胞接種到新的環(huán)境（如從固體培養(yǎng)基接種到液體培養(yǎng)基）后，需要重新合成必需的酶類、輔酶或某些中間代謝產(chǎn)物，以適應新的環(huán)境而出現(xiàn)生長的延滯期。
為了提高生產(chǎn)效率，發(fā)酵工業(yè)中常常要采取措施縮短延滯期，具有十分重要的意義，其方法主要有：1）以對數(shù)期的菌體作種子菌，因?qū)?shù)期的菌體生長代謝旺盛，繁殖力強，抗不良環(huán)境和噬菌體的能力強，采用對數(shù)期的菌體作種子，延滯期就短。2）適當增大接種量，生產(chǎn)上接種量的多少是影響延滯期的一個重要因素 ，接種量大，延滯期短，接種量小，則延滯期長。一般采用3%~8%的接種量，根據(jù)生產(chǎn)上的具體情況而定，最高不超過1/10。3）培養(yǎng)基的成分 為了縮短培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分差異，常常在種子培養(yǎng)基中加入生產(chǎn)培養(yǎng)基的某些營養(yǎng)成分，即是種子培養(yǎng)基盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基，通常微生物生長在營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中比營養(yǎng)單調(diào)的組合培養(yǎng)基中快。
⑵ 對數(shù)期（logarithmic phase）
又叫指數(shù)期，指在生長曲線中，緊接著延滯期后的一段時期。此時菌體細胞生長的速率常數(shù)R最大，分裂快，細胞每分裂繁殖一次的增代時間（即代時，generation time）短，細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級數(shù)增加，群體的形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境的能力強。
在對數(shù)期中，以下三個參數(shù)尤為重要。
1) 繁殖代數(shù)（n）由圖4-2可以得出：
x2 = x1 · 2n
以對數(shù)表示：lgx2 =lgx1＋nlg2
∴ n= = 3.322(lgx2－lgx1)
2) 生長速率常數(shù)（R） 如前所述生長速率常數(shù)的定義的可知 ：
R = =
3) 代時（G） 如前所述平均代時的定義可知：
G = =
影響微生物對數(shù)期增代時間的因素較多，主要有：
菌種 ：不同微生物代時差別大，即使是同一菌種，由于培養(yǎng)基成分和物理條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的pH和營養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)）的不同，其對數(shù)期的代時也不同。但是，在一定條件下，各種菌的代時是相對穩(wěn)定的，多數(shù)為20~30分鐘，有的長達33小時，快的只有9.8分鐘左右。如表4-1。
表4-1 不同細菌的代時
細 菌 培養(yǎng)基 溫度（℃） 代時（分）
漂浮假單胞菌（Pseudomonas natriegenes） 肉湯 27 37 9. 8
大腸桿菌（Escherichia coli） 肉湯 37 17
蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus） 肉湯 30 18
嗜熱芽孢桿菌（Bacillus thermophilus） 肉湯 55 18.3
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 肉湯 25 26 –32
巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium） 肉湯 30 31
乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis） 牛乳 37 26
嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） 牛乳 37 66 –87
傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi） 肉湯 37 23 .5
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 肉湯 37 27 –30
霍亂弧菌（Vibrio cholerae） 肉湯 37 21 –38
丁酸梭菌（Clostridium butyricum） 玉米醪 30 51
大豆根瘤菌（Rhizobium japonicum） 葡萄糖 25 344 – 461
結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis） 合成 37 792 –932
活躍硝化桿菌（Nitrobacter agilis） 合成 27 1200
梅毒密螺旋體（Treponema pallidum） 家兔 37 1980
褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum） 葡萄糖 25 240
營養(yǎng)成分：同種細菌，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其代時就短，反之則長。
培養(yǎng)溫度：溫度是影響微生物生長速率的重要物理因素。
在微生物的最適生長溫度范圍時，代時就短。如表4-2
表4 –2 大腸桿菌在不同溫度下的代時
溫度（℃） 代時（分） 溫度（℃） 代時（分）
10 860 35 22
15 120 40 17.5
20 90 45 20
25 40 47.5 77
30 29
⑶ 穩(wěn)定期 （stationary phase）
又叫最高生長期或恒定期。處于穩(wěn)定期的微生物其特點是新繁殖的細胞數(shù)與衰亡細胞數(shù)幾乎相等，即是正生長與負生長達動態(tài)平衡，此時生長速度逐漸趨向于零。
出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因主要有1）營養(yǎng)物質(zhì)特別是生長限制因子的耗盡，營養(yǎng)物質(zhì)的比例失調(diào)，例如C/N比值不合適等；2）酸、醇、毒素或過氧化氫等有害代謝產(chǎn)物的累積；3）pH、氧化還原勢等環(huán)境條件越來越不適宜等。
穩(wěn)定期是以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物，例如單細胞蛋白、乳酸等為目的的一些發(fā)酵生產(chǎn)的最佳收獲期，也是對某些生長因子例如維生素和氨基酸等進行生物測定的必要前提。穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達到了最高水平，產(chǎn)物的積累也達到了高峰，這時，菌體的總產(chǎn)量與所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)之間存在著一定關系。此外，由于對穩(wěn)定期到來的原因進行研究，促進了連續(xù)培養(yǎng)技術的產(chǎn)生和研究。生產(chǎn)上常常通過補料、調(diào)節(jié)溫度和pH等措施，延長穩(wěn)定期，以積累更多的代謝產(chǎn)物。
⑷ 衰亡期（decline phase或 death phase）
穩(wěn)定期后，微生物死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負生長”（R為負值），此階段叫衰亡期。這時，細胞形態(tài)多樣，例如產(chǎn)生很多膨大、不規(guī)則的退化形態(tài)；有的細胞內(nèi)多液泡，革蘭氏染色反應為陽性的變成陰性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增強發(fā)生自溶（autolysis）；有的微生物在這時產(chǎn)生抗生素等次生代謝產(chǎn)物；對于芽孢桿菌，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時期。
產(chǎn)生衰亡期的原因主要是外界環(huán)境對繼續(xù)生長的微生物越來越不利，從而引起微生物細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，導致菌體死亡。
1.3.2 微生物的連續(xù)培養(yǎng)
連續(xù)培養(yǎng)( continuous culture )又叫開放培養(yǎng)( open culture )，是相對分批培養(yǎng)( batch culture )或密閉培養(yǎng)( closed culture )而言的。
微生物置與于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)一段時間后，最后一次性地收獲，稱分批培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是一次性加入，不再補充，隨著微生物的生長繁殖活躍，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，有害代謝產(chǎn)物不斷積累，細菌的對數(shù)生長期不可能長時間維持。連續(xù)培養(yǎng)是在研究典型生長曲線的基礎上，認識到了穩(wěn)定期到來的原因，采取在培養(yǎng)器中不斷補充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)，并攪拌均勻；另一方面，及時不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物（包括菌體和代謝產(chǎn)物）。這樣，培養(yǎng)物就達動態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率上。連續(xù)培養(yǎng)不僅可隨時為微生物的研究工作提供一定生理狀態(tài)的實驗材料，而且可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動化水平，此法已成為目前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。
連續(xù)培養(yǎng)的方法主要有兩類：
(1) 恒濁法 其原理是根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，用光電控制系統(tǒng)（濁度計）來檢測培養(yǎng)液的濁度（即菌液濃度），并控制培養(yǎng)液的流速，從而獲得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)液。當培養(yǎng)器中濁度增高時，通過光電控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，可促使培養(yǎng)液流速加快，反之則慢，以此來達到恒密度的目的。
在恒濁器中的微生物，始終能以最高生長速率進行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度。在生產(chǎn)實踐上，為了獲得大量菌體或與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物如乳酸、乙醇時，可以采用恒濁法。
(2) 恒化法 與恒濁法不同的是，恒化法是使培養(yǎng)液流速保持不變，即控制在恒定的流速，使微生物始終在低于最高生長速率條件下進行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)方法。常常通過控制某一種營養(yǎng)物的濃度，使其成為限制性的因子，而其他營養(yǎng)物均為過量，這樣，細菌的生長速率將取決于限制性因子的濃度。隨著細菌的生長，菌體的密度會隨時間的增長而增高，而限制性生長因子的濃度又會隨時間的增長而降低，兩者互相作用的結(jié)果，出現(xiàn)微生物的生長速率正好與恒速加入的新鮮培養(yǎng)基流速相平衡。這樣，既可獲得一定生長速率的均一菌體，又可獲得雖低于最高菌體產(chǎn)量，但能保持穩(wěn)定菌體密度的菌體。
恒化法連續(xù)培養(yǎng)主要用于實驗室的科學研究中，特別是用于與生長速率相關的各種理論研究中。
連續(xù)培養(yǎng)如用于發(fā)酵工業(yè)中，就稱為連續(xù)發(fā)酵（continuous fermentation）。連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點：①自控性 ，便于利用各種儀表進行自動控制，②高效，它使裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等工藝簡化了，縮短了生產(chǎn)時間和提高了設備的利用效率，③產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定，④節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，使水、汽、電的負荷減少；但也存在不足之處：①主要是菌種易于退化，使微生物長期處于高速繁殖的條件下，即使是自發(fā)突變率很低，也難以避免變異的發(fā)生，②容易污染，在連續(xù)發(fā)酵中，要保持各種設備無滲漏，通氣系統(tǒng)不出任何故障，是極其困難的。因此，“連續(xù)”是有時間限制的，一般可達數(shù)月至一年、兩年，③連續(xù)培養(yǎng)中，營養(yǎng)物的利用率低于分批培養(yǎng)。
在發(fā)酵工業(yè)中，連續(xù)培養(yǎng)技術已廣泛用于酵母單細胞蛋白的生產(chǎn)，乙醇、乳酸、丙酮和丁醇等發(fā)酵，以及用假絲酵母（Candida spp.）進行石油脫蠟或是污水處理中。
1.3.3 微生物的同步培養(yǎng)
如上所述，在分批培養(yǎng)中，細菌群體以一定速率生長，但所有細胞并非同時進行分裂，即是培養(yǎng)中的細胞不處于同一生長階段，它們的生理狀態(tài)和代謝活動也不完全一樣。要研究每個細胞所發(fā)生的變化是很困難的。為了解決這一問題，就必須設法使微生物群體處于同一發(fā)育階段，使群體和個體行為變得一致，所有的細胞都能同時分裂，因而發(fā)展了單細胞的同步培養(yǎng)（synchronous culture）技術。
獲得細菌同步培養(yǎng)的方法主要有兩類，其一是調(diào)整生理條件誘導同步性，主要是通過控制環(huán)境條件如溫度、光線和處于穩(wěn)定期的培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基等來誘導同步；其二是機械法（又稱選擇法），它是利用物理方法從不同步的細菌群體中選擇出同步的群體，一般可用過濾分離法或梯度離心法來達到。在這兩種方法中，由于誘導法可能導致與正常細胞循環(huán)周期不同的周期變化，所以不及選擇法好，這在生理學研究中尤其明顯。
在選擇法中，有代表性的是硝酸纖維素薄膜法（Helmstetter-Cummings）。根據(jù)某些細菌會粘附在硝酸纖維微孔濾膜上的原理，設計了一個具體的選擇方法：將非同步的細菌液體培養(yǎng)物通過微孔濾膜，讓細胞吸附于其上；然后將濾膜反置，再以新鮮培養(yǎng)液濾過。這時，一些沒有粘牢固的細胞先被沖洗掉，接著脫落的是那些新分裂形成的細胞，于是就獲得了同步生長。見圖4-3：
圖4-3 用Helmstetter-Cummings法獲得同步生長的細菌
值得注意的是，同步生長的細菌，在培養(yǎng)的過程中會很快喪失其同步性。例如，在第一個細胞分裂周期中，開始細胞數(shù)一直不增加，到后來，數(shù)目突然增加一倍。在第二個分裂周期時，情況就沒有那么明顯了，到第三個周期時，幾乎完全喪失同步性。其原因是不同個體間，細胞分裂周期一般都有較大的差別。
一個微生物細胞在合適的外界環(huán)境條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按其自身的代謝方式進行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量、體積、大�。┚筒粩嘣黾�，于是出現(xiàn)了個體的生長現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長，即各細胞組分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，從而引起個體數(shù)目的增加，這時，原有的個體已經(jīng)發(fā)展成一個群體。隨著群體中各個個體的進一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其重量、體積、密度或濃度作指標來衡量。所以：
個體生長→個體繁殖→群體生長
群體生長＝個體生長＋個體繁殖
這里需要強調(diào)的是，上述微生物生長的階段性，對于單細胞微生物來說是不明顯的，往往在個體生長的同時，伴隨著個體的繁殖，這一特點，在細菌快速生長階段尤為突出，有時在一個細胞中出現(xiàn)2或4個細胞核；除了特定的目的以外，在微生物的研究和應用中，只有群體的生長才有實際意義，因此，在微生物學中提到的“生長”，均指群體生長。這一點與研究高等生物時有所不同。
微生物的生長繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映，因此，生長繁殖情況就可作為研究各種生理、生化和遺傳等問題的重要指標；同時，微生物在生產(chǎn)實踐上的各種應用或是對致病、霉腐微生物的防治，也都與它們的生長繁殖和抑制緊密相關。下面對微生物的生長繁殖及其控制的規(guī)律作較詳細的介紹。
1.2微生物生長量的測定
既然生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定生長的方法也都直接地以此為根據(jù)，而測定繁殖則都要建立在計數(shù)這一基礎上。
1.2.1 稀釋平板菌落計數(shù)法
是一種最常用的活菌計數(shù)法。取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在其凝固前均勻混合，或涂布于已凝固的固體培養(yǎng)基平板上。在最適條件下培養(yǎng)后，從平板上（內(nèi)）出現(xiàn)的菌落數(shù)乘上菌液的稀釋度，即可計算出原菌液的含菌數(shù)。在一個9cm直徑的培養(yǎng)皿平板上，一般以出現(xiàn)50～500個菌落為宜。
這種方法在操作時，有較高的技術要求。其中最重要的是應使樣品充分混勻，并讓每支移液管只能接觸一個稀釋度的菌液。有人認為，對原菌液濃度為109個/mL的微生物來說，如果第一次稀釋即采用10-4級（用10μL菌液至100mL無菌水中），第二次采用10-2級（吸1mL上述稀釋液至100mL無菌水中），然后再吸此菌液0.2mL進行表面涂布和菌落計數(shù)，則所得的結(jié)果最為精確。其主要原因是，一般的吸管壁常因存在油脂而影響計數(shù)的精確度（有時誤差竟高達15％）。這一稀釋過程的示意圖詳見實驗技術。
1.2.2 血球計數(shù)板法
是用來測定一定容積中的細胞總數(shù)目的常規(guī)方法（詳見第十章實驗五）。這種方法的特點是測定簡便、直接、快速，但測定的對象有一定的局限性，只適合于個體較大的微生物種類，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外測定結(jié)果是微生物個體的總數(shù)，其中包括死亡的個體和存活的個體，要想測定活菌的個數(shù)，還必須借助其它方法配合。
1.2.3 稱干重
可用離心法或過濾法測定，一般干重為濕重的10%～20%。在離心法中，將待測培養(yǎng)液放入離心管中，用清水離心洗滌1～5次后，進行干燥。干燥溫度可采用105℃、100℃或紅外線烘干，也可在較低的溫度（80℃或40℃）下進行真空干燥，然后稱干重。以細菌為例，一個細胞一般重約10-12～10-13g。
另一種方法為過濾法。絲狀真菌可用濾紙過濾，而細菌則可用醋酸纖維膜等濾膜進行過濾。過濾后，細胞可用少量水洗滌，然后在40℃下真空干燥，稱干重。以大腸桿菌為例，在液體培養(yǎng)物中，細胞的濃度可達2×108個/mL。100mL培養(yǎng)物可得10～90mg干重的細胞。
這種方法較適合于絲狀微生物的生長量的測定，對于細菌來說，一般在實驗室或生產(chǎn)實踐中較少使用。
1.2.4 比濁法
細菌培養(yǎng)物在其生長過程中，由于原生質(zhì)含量的增加，會引起培養(yǎng)物混濁度的增高。最古老的比濁法是采用MoFarland比濁管。這是用不同濃度的BaCl2與稀H2SO4配制成的10支試管，其中形成的BaSO4有10個梯度，分別代表10個相對的細菌濃度（預先用相應的細菌測定）。某一未知濃度的菌液只要在透射光下用肉眼與某一比濁管進行比較，如果兩者透光度相當，即可目測出該菌液的大致濃度。
如果要作精確測定，則可用分光光度計進行。在可見光的450～650nm波段內(nèi)均可測定。為了對某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時跟蹤，可采用不必取樣的側(cè)壁三角燒瓶來進行。測定時，只要把瓶內(nèi)的培養(yǎng)液倒入側(cè)臂管中，然后將此管插入特制的光電比色計比色座孔中，即可隨時測出生長情況，而不必取用菌液（圖5-1）。
圖5-1 測定生長用的側(cè)臂三角燒瓶
1. 側(cè)臂試管三角燒瓶；2. 側(cè)臂試管；3. 側(cè)臂試管插座；4. 比色架面板；
5. 連接螺絲；6. 比濁測定透光窗；7. 光路開關孔；8. 比色架底板
以上介紹了若干測定微生物的生長量或計算繁殖數(shù)的主要方法。其中，最常用的為稱干重、測濁度（用分光光度計）用計數(shù)板測總菌數(shù)以及用平板菌落計數(shù)法測活菌數(shù)等方法。必須指出的是，不管用什么方法，都有其優(yōu)缺點和使用范圍。所以，在使用前，一定要根據(jù)自己的研究對象和研究目的的不同，選用最合適的方法。
1.3 微生物的群體生長規(guī)律
單細胞的微生物，如細菌、酵母菌在液體培養(yǎng)基中，可以均勻地分布，每個細胞接觸的環(huán)境條件相同，都有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，故每個細胞都迅速地生長繁殖。霉菌多數(shù)是多細胞微生物，菌體呈絲狀，在液體培養(yǎng)基中生長繁殖的情況與單細胞微生物不一樣，如果采取搖床培養(yǎng)，則霉菌在液體培養(yǎng)中的生長繁殖情況，近似于單細胞微生物。因液體被攪動，菌絲處于分布比較均勻的狀態(tài)，而且菌絲在生長繁殖過程中不會象在固體培養(yǎng)基上那樣有分化現(xiàn)象，孢子產(chǎn)生也較少。
1.3.1典型的生長曲線
微生物生長繁殖的速度非�？欤话慵毦谶m宜的條件下，大約20~30分鐘就可以分裂一次，如果不斷迅速地分裂，短時間內(nèi)可達驚人的數(shù)目，但實際上是不可能的。在培養(yǎng)條件保持穩(wěn)定的狀況下，定時取樣測定培養(yǎng)液中微生物的菌體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的開始階段，菌體數(shù)目并不增加，一定時間后，菌體數(shù)目就增長很快，繼而菌體數(shù)目增長速度保持穩(wěn)定，最后增長速度逐漸下降以致等于零。如果以培養(yǎng)時間為橫坐標，以以活菌數(shù)的對數(shù)值作縱坐標，就可作出一條生長曲線。這生長曲線（growth curve）代表單細胞微生物從生長開始到衰老死亡的一般規(guī)律。
根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growth rate constant），即每小時的分裂代數(shù)的不同，一般把典型的生長曲線粗分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個時期。見圖4-1：
⑴ 延滯期（lag phase）
又叫適應期、緩慢期或調(diào)整期，是指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液剛開始的一段時間細胞數(shù)目不增加的時期，甚至細胞數(shù)目還可能減少。延滯期有如下特點：1）生長的速率常數(shù)為零。2）細胞的體積增大，DNA、含量增多為分裂作準備。3）合成代謝旺盛，核糖體、酶類和的合成加快，易產(chǎn)生誘導酶。4）對不良環(huán)境敏感，例如pH、Nacl溶液濃度、溫度和抗生素等化學物質(zhì)。
延滯期出現(xiàn)的原因，可能是為了重新調(diào)整代謝。當細胞接種到新的環(huán)境（如從固體培養(yǎng)基接種到液體培養(yǎng)基）后，需要重新合成必需的酶類、輔酶或某些中間代謝產(chǎn)物，以適應新的環(huán)境而出現(xiàn)生長的延滯期。
為了提高生產(chǎn)效率，發(fā)酵工業(yè)中常常要采取措施縮短延滯期，具有十分重要的意義，其方法主要有：1）以對數(shù)期的菌體作種子菌，因?qū)?shù)期的菌體生長代謝旺盛，繁殖力強，抗不良環(huán)境和噬菌體的能力強，采用對數(shù)期的菌體作種子，延滯期就短。2）適當增大接種量，生產(chǎn)上接種量的多少是影響延滯期的一個重要因素 ，接種量大，延滯期短，接種量小，則延滯期長。一般采用3%~8%的接種量，根據(jù)生產(chǎn)上的具體情況而定，最高不超過1/10。3）培養(yǎng)基的成分 為了縮短培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分差異，常常在種子培養(yǎng)基中加入生產(chǎn)培養(yǎng)基的某些營養(yǎng)成分，即是種子培養(yǎng)基盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基，通常微生物生長在營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中比營養(yǎng)單調(diào)的組合培養(yǎng)基中快。
⑵ 對數(shù)期（logarithmic phase）
又叫指數(shù)期，指在生長曲線中，緊接著延滯期后的一段時期。此時菌體細胞生長的速率常數(shù)R最大，分裂快，細胞每分裂繁殖一次的增代時間（即代時，generation time）短，細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級數(shù)增加，群體的形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境的能力強。
在對數(shù)期中，以下三個參數(shù)尤為重要。
1) 繁殖代數(shù)（n）由圖4-2可以得出：
x2 = x1 · 2n
以對數(shù)表示：lgx2 =lgx1＋nlg2
∴ n= = 3.322(lgx2－lgx1)
2) 生長速率常數(shù)（R） 如前所述生長速率常數(shù)的定義的可知 ：
R = =
3) 代時（G） 如前所述平均代時的定義可知：
G = =
影響微生物對數(shù)期增代時間的因素較多，主要有：
菌種 ：不同微生物代時差別大，即使是同一菌種，由于培養(yǎng)基成分和物理條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的pH和營養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)）的不同，其對數(shù)期的代時也不同。但是，在一定條件下，各種菌的代時是相對穩(wěn)定的，多數(shù)為20~30分鐘，有的長達33小時，快的只有9.8分鐘左右。如表4-1。
表4-1 不同細菌的代時
細 菌 培養(yǎng)基 溫度（℃） 代時（分）
漂浮假單胞菌（Pseudomonas natriegenes） 肉湯 27 37 9. 8
大腸桿菌（Escherichia coli） 肉湯 37 17
蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus） 肉湯 30 18
嗜熱芽孢桿菌（Bacillus thermophilus） 肉湯 55 18.3
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 肉湯 25 26 –32
巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium） 肉湯 30 31
乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis） 牛乳 37 26
嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） 牛乳 37 66 –87
傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi） 肉湯 37 23 .5
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 肉湯 37 27 –30
霍亂弧菌（Vibrio cholerae） 肉湯 37 21 –38
丁酸梭菌（Clostridium butyricum） 玉米醪 30 51
大豆根瘤菌（Rhizobium japonicum） 葡萄糖 25 344 – 461
結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis） 合成 37 792 –932
活躍硝化桿菌（Nitrobacter agilis） 合成 27 1200
梅毒密螺旋體（Treponema pallidum） 家兔 37 1980
褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum） 葡萄糖 25 240
營養(yǎng)成分：同種細菌，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其代時就短，反之則長。
培養(yǎng)溫度：溫度是影響微生物生長速率的重要物理因素。
在微生物的最適生長溫度范圍時，代時就短。如表4-2
表4 –2 大腸桿菌在不同溫度下的代時
溫度（℃） 代時（分） 溫度（℃） 代時（分）
10 860 35 22
15 120 40 17.5
20 90 45 20
25 40 47.5 77
30 29
⑶ 穩(wěn)定期 （stationary phase）
又叫最高生長期或恒定期。處于穩(wěn)定期的微生物其特點是新繁殖的細胞數(shù)與衰亡細胞數(shù)幾乎相等，即是正生長與負生長達動態(tài)平衡，此時生長速度逐漸趨向于零。
出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因主要有1）營養(yǎng)物質(zhì)特別是生長限制因子的耗盡，營養(yǎng)物質(zhì)的比例失調(diào)，例如C/N比值不合適等；2）酸、醇、毒素或過氧化氫等有害代謝產(chǎn)物的累積；3）pH、氧化還原勢等環(huán)境條件越來越不適宜等。
穩(wěn)定期是以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物，例如單細胞蛋白、乳酸等為目的的一些發(fā)酵生產(chǎn)的最佳收獲期，也是對某些生長因子例如維生素和氨基酸等進行生物測定的必要前提。穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達到了最高水平，產(chǎn)物的積累也達到了高峰，這時，菌體的總產(chǎn)量與所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)之間存在著一定關系。此外，由于對穩(wěn)定期到來的原因進行研究，促進了連續(xù)培養(yǎng)技術的產(chǎn)生和研究。生產(chǎn)上常常通過補料、調(diào)節(jié)溫度和pH等措施，延長穩(wěn)定期，以積累更多的代謝產(chǎn)物。
⑷ 衰亡期（decline phase或 death phase）
穩(wěn)定期后，微生物死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負生長”（R為負值），此階段叫衰亡期。這時，細胞形態(tài)多樣，例如產(chǎn)生很多膨大、不規(guī)則的退化形態(tài)；有的細胞內(nèi)多液泡，革蘭氏染色反應為陽性的變成陰性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增強發(fā)生自溶（autolysis）；有的微生物在這時產(chǎn)生抗生素等次生代謝產(chǎn)物；對于芽孢桿菌，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時期。
產(chǎn)生衰亡期的原因主要是外界環(huán)境對繼續(xù)生長的微生物越來越不利，從而引起微生物細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，導致菌體死亡。
1.3.2 微生物的連續(xù)培養(yǎng)
連續(xù)培養(yǎng)( continuous culture )又叫開放培養(yǎng)( open culture )，是相對分批培養(yǎng)( batch culture )或密閉培養(yǎng)( closed culture )而言的。
微生物置與于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)一段時間后，最后一次性地收獲，稱分批培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是一次性加入，不再補充，隨著微生物的生長繁殖活躍，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，有害代謝產(chǎn)物不斷積累，細菌的對數(shù)生長期不可能長時間維持。連續(xù)培養(yǎng)是在研究典型生長曲線的基礎上，認識到了穩(wěn)定期到來的原因，采取在培養(yǎng)器中不斷補充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)，并攪拌均勻；另一方面，及時不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物（包括菌體和代謝產(chǎn)物）。這樣，培養(yǎng)物就達動態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率上。連續(xù)培養(yǎng)不僅可隨時為微生物的研究工作提供一定生理狀態(tài)的實驗材料，而且可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動化水平，此法已成為目前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。
連續(xù)培養(yǎng)的方法主要有兩類：
(1) 恒濁法 其原理是根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，用光電控制系統(tǒng)（濁度計）來檢測培養(yǎng)液的濁度（即菌液濃度），并控制培養(yǎng)液的流速，從而獲得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)液。當培養(yǎng)器中濁度增高時，通過光電控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，可促使培養(yǎng)液流速加快，反之則慢，以此來達到恒密度的目的。
在恒濁器中的微生物，始終能以最高生長速率進行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度。在生產(chǎn)實踐上，為了獲得大量菌體或與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物如乳酸、乙醇時，可以采用恒濁法。
(2) 恒化法 與恒濁法不同的是，恒化法是使培養(yǎng)液流速保持不變，即控制在恒定的流速，使微生物始終在低于最高生長速率條件下進行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)方法。常常通過控制某一種營養(yǎng)物的濃度，使其成為限制性的因子，而其他營養(yǎng)物均為過量，這樣，細菌的生長速率將取決于限制性因子的濃度。隨著細菌的生長，菌體的密度會隨時間的增長而增高，而限制性生長因子的濃度又會隨時間的增長而降低，兩者互相作用的結(jié)果，出現(xiàn)微生物的生長速率正好與恒速加入的新鮮培養(yǎng)基流速相平衡。這樣，既可獲得一定生長速率的均一菌體，又可獲得雖低于最高菌體產(chǎn)量，但能保持穩(wěn)定菌體密度的菌體。
恒化法連續(xù)培養(yǎng)主要用于實驗室的科學研究中，特別是用于與生長速率相關的各種理論研究中。
連續(xù)培養(yǎng)如用于發(fā)酵工業(yè)中，就稱為連續(xù)發(fā)酵（continuous fermentation）。連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點：①自控性 ，便于利用各種儀表進行自動控制，②高效，它使裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等工藝簡化了，縮短了生產(chǎn)時間和提高了設備的利用效率，③產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定，④節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，使水、汽、電的負荷減少；但也存在不足之處：①主要是菌種易于退化，使微生物長期處于高速繁殖的條件下，即使是自發(fā)突變率很低，也難以避免變異的發(fā)生，②容易污染，在連續(xù)發(fā)酵中，要保持各種設備無滲漏，通氣系統(tǒng)不出任何故障，是極其困難的。因此，“連續(xù)”是有時間限制的，一般可達數(shù)月至一年、兩年，③連續(xù)培養(yǎng)中，營養(yǎng)物的利用率低于分批培養(yǎng)。
在發(fā)酵工業(yè)中，連續(xù)培養(yǎng)技術已廣泛用于酵母單細胞蛋白的生產(chǎn)，乙醇、乳酸、丙酮和丁醇等發(fā)酵，以及用假絲酵母（Candida spp.）進行石油脫蠟或是污水處理中。
1.3.3 微生物的同步培養(yǎng)
如上所述，在分批培養(yǎng)中，細菌群體以一定速率生長，但所有細胞并非同時進行分裂，即是培養(yǎng)中的細胞不處于同一生長階段，它們的生理狀態(tài)和代謝活動也不完全一樣。要研究每個細胞所發(fā)生的變化是很困難的。為了解決這一問題，就必須設法使微生物群體處于同一發(fā)育階段，使群體和個體行為變得一致，所有的細胞都能同時分裂，因而發(fā)展了單細胞的同步培養(yǎng)（synchronous culture）技術。
獲得細菌同步培養(yǎng)的方法主要有兩類，其一是調(diào)整生理條件誘導同步性，主要是通過控制環(huán)境條件如溫度、光線和處于穩(wěn)定期的培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基等來誘導同步；其二是機械法（又稱選擇法），它是利用物理方法從不同步的細菌群體中選擇出同步的群體，一般可用過濾分離法或梯度離心法來達到。在這兩種方法中，由于誘導法可能導致與正常細胞循環(huán)周期不同的周期變化，所以不及選擇法好，這在生理學研究中尤其明顯。
在選擇法中，有代表性的是硝酸纖維素薄膜法（Helmstetter-Cummings）。根據(jù)某些細菌會粘附在硝酸纖維微孔濾膜上的原理，設計了一個具體的選擇方法：將非同步的細菌液體培養(yǎng)物通過微孔濾膜，讓細胞吸附于其上；然后將濾膜反置，再以新鮮培養(yǎng)液濾過。這時，一些沒有粘牢固的細胞先被沖洗掉，接著脫落的是那些新分裂形成的細胞，于是就獲得了同步生長。見圖4-3：
圖4-3 用Helmstetter-Cummings法獲得同步生長的細菌
值得注意的是，同步生長的細菌，在培養(yǎng)的過程中會很快喪失其同步性。例如，在第一個細胞分裂周期中，開始細胞數(shù)一直不增加，到后來，數(shù)目突然增加一倍。在第二個分裂周期時，情況就沒有那么明顯了，到第三個周期時，幾乎完全喪失同步性。其原因是不同個體間，細胞分裂周期一般都有較大的差別。