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維生素D的測(cè)定方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2005-10-26
高效液相色譜法

1. 原理
  樣品中脂溶性維生素在皂化過程中與脂肪分離,以石油醚萃取后,用正相色譜柱提取富集,用反相色譜柱,紫外檢測(cè)器定量測(cè)定。

2. 適用范圍
  本方法來源于GB/T 5413.9-1997。適用于嬰幼兒配方食品和乳粉維生素A、維生素D、維生素E的測(cè)定;也適用于食品或強(qiáng)經(jīng)食品及飼料中的維生素D含量的測(cè)定。

3. 主要儀器
1) 高壓液相色譜儀,具有可變波長的紫外檢測(cè)器,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或記錄儀。
2) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
3) 平底燒瓶:250mL。
4) 分液漏斗:500mL。

4. 試劑
  所有試劑,如未注明規(guī)格,均指分析純,所實(shí)驗(yàn)用水均指蒸餾水。
1) 異丙醇:色譜純。
2) 2%焦性沒食子酸乙醇溶液:取2g焦性沒食子酸溶液于100mL無水乙醇中。
3) 75%氫氧化鉀溶液:取75g氫氧化鉀溶于100mL水中。
4) 石油醚:沸程30~60℃。
5) 甲醇:色譜純。
6) 正己烷:色譜純。
7) 環(huán)己烷:色譜醇。
8) 維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液
A. 維生素D2標(biāo)準(zhǔn)貯備液:含維生素D2100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D2,用甲醇定容于100mL容量瓶中。
B. 維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)貯備液:含維生素D3100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D3,用甲醇定容于100mL容量瓶中。

5. 操作步驟

5.1樣品處理:準(zhǔn)確稱取10g樣品,于250mL平底燒瓶中,加30mL蒸餾水。

5.2測(cè)定液的制備:
1) 于上述樣品溶液中加入100mL的20%沒食子酸乙醇溶液,充分混勻后加50mL75%氫氧化鉀溶液,在蒸汽浴上邊續(xù)回流30min后,立刻冷卻到室溫。
2) 將皂化液轉(zhuǎn)入一500mL分液漏斗中,用100mL水分幾次沖平底燒瓶。洗滌液并入分液漏斗中。
3) 于上述分液漏斗中,加入100mL石油醚,蓋好瓶塞,倒置分液漏斗并劇烈振搖1 min.在振搖過程中,注意釋放瓶內(nèi)壓力。靜置分層,將水相放入另一500mL分液漏斗中,重復(fù)上棕萃取過程2次,合并醚液到第一個(gè)分液漏斗中。用蒸餾水洗該醚液至中性,通過無水硫酸鈉過濾干燥,在40℃和氮?dú)饬飨,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸至近于(絕不允許蒸干)后,用石油醚轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,定容。
4) 從上述容量瓶中取7mL放入一試管中,用氮?dú)鈱⑹兔汛蹈桑谠嚬苤屑?mL正己烷。

5.3測(cè)定:
1) 測(cè)定液的制備:
A) 儀器條件:
色譜柱:30cm×40cm,硅膠柱。
流動(dòng)相:正己烷與環(huán)己烷按體積比1:1混合,并按體積分?jǐn)?shù)0.8%加入異丙醇。
流速:1mL/min。
波長:265nm。
柱溫:20℃。
靈敏度:0.005AU/MV。
注射體積:200mL。
B) 注射50mL維生素D標(biāo)樣和200mL樣品溶液,根據(jù)維生素D標(biāo)樣保留時(shí)間收集維生素D于試管中,將試管用氮?dú)獯蹈,?zhǔn)確加入0.2mL甲醇溶解。
2) 測(cè)定步驟:
A) 儀器條件:
色譜柱:4.6mm×25cm,C18或具同等性能的色譜柱。
流動(dòng)相:甲醇。
流速:1mL/min。
波長:265nm。
柱溫:20℃。
靈敏度:0.005AU/MV。
注射體積:50mL。
B) 注射50mL維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液,注射50mL樣品溶液,得到標(biāo)樣和樣品溶液中維生素D峰面積或峰高。
6. 計(jì)算

ρs×10∕7×40×100
X =
m
As
ρs= ---×ρsd
Asd
式中: X--樣品維生素D的量,mg/100g;
m--稱樣量,含量,IU∕100g;
ρs --進(jìn)樣液中維生素D有濃度,mg/mL;
A s --進(jìn)樣液中維生素D有峰高(或峰面積);
A s d --標(biāo)樣液中維生素D有峰高(或峰面積);
ρsd --標(biāo)樣中維生素D的濃度;
計(jì)算結(jié)果精確至小數(shù)點(diǎn)后一位。

7. 注意事項(xiàng)
1) 允許誤差及最小檢出量:同一樣品的2次測(cè)定值之差不得超過2次測(cè)定平均值的10%;最小檢出量為0.1國標(biāo)單位。
2) 試劑焦性沒食子酸容易變性,應(yīng)購習(xí)近期生產(chǎn)的試劑。
3) 如果皂化不完全,可適當(dāng)增加氫氧化鉀的加入量。
 
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