六、奶牛胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的相關(guān)技術(shù)

    胚胎生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要內(nèi)容之一，所包括的具體技術(shù)內(nèi)容和研究的熱點(diǎn)很多，有些技術(shù)已比較成熟，開(kāi)始或即將用于胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的實(shí)踐，但尚有很多技術(shù)內(nèi)容仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，離實(shí)際應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)木嚯x。
  （一） 、胚胎的冷凍保存
    胚胎冷凍保存的成功使奶牛的胚胎移植不再受時(shí)間和空間的限制，完全可以根據(jù)受體母牛的發(fā)情情況人為確定胚胎移植的時(shí)間。其次，使胚胎的國(guó)際、國(guó)內(nèi)交換以及長(zhǎng)期保存成為可能，大大推動(dòng)了胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。
    目前常用的胚胎冷凍方法主要有兩種：
    1、慢性冷凍保存
    此法是將胚胎置于抗凍保護(hù)劑溶液中，經(jīng)緩慢降溫，一般降溫速度為1每分鐘攝氏度到3每分鐘攝氏度，達(dá)到一定的溫度后投入液氮（-196攝氏度），即可長(zhǎng)期保存。經(jīng)冷凍保存的胚胎在移植前經(jīng)解凍進(jìn)行移植。這種方法由于降溫速度慢，可在胚胎完全凍結(jié)前脫出細(xì)胞內(nèi)的水分，防止冰晶形成對(duì)胚胎的傷害。整個(gè)冷凍過(guò)程需要2-4小時(shí)，比較費(fèi)時(shí)。目前已有各種類型的胚胎冷凍儀，可以進(jìn)行電腦程序控制，保證了每一批的冷凍質(zhì)量。該法已在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，成為一種常規(guī)的胚胎冷凍保存方法。
    2、玻璃化冷凍保存
    此法是將胚胎置于特制的高濃度的冷凍保護(hù)液中，只需要幾分鐘的平衡時(shí)間即投入液氮中完成冷凍保存過(guò)程。胚胎解凍后的生存能力不低于慢速冷凍保存。此法不需冷凍儀和特殊設(shè)備，在沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)場(chǎng)條件下即可操作。由于整個(gè)冷凍過(guò)程只需幾分種的時(shí)間，縮短了操作的時(shí)間，具有很好的推廣和應(yīng)用前景。
  （二） 、體外受精
    奶牛的體外受精是指精子和卵子在體外人為控制的實(shí)驗(yàn)室條件下完成受精的技術(shù)，也是奶牛胚胎生產(chǎn)的方式之一，以這種方式得到的胚胎叫體外胚胎。
    目前，進(jìn)行體外受精的卵子（卵母細(xì)胞）有兩種獲取方法：
    1、宰場(chǎng)剛屠宰的母牛體內(nèi)摘取卵巢，以一定的方法處理后，從卵巢上收集卵母細(xì)胞，要求卵泡直徑為3-10亳米。然后將這些卵母細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)成熟，再與經(jīng)獲能處理的公牛精子放在一起完成受精，繼而把受精卵培養(yǎng)至囊胚階段進(jìn)行移植或冷凍保存。從廢棄的卵巢中采集卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的方式，材料來(lái)源豐富，生產(chǎn)成本低，便于工廠化操作，可做到成批生產(chǎn)的目的。存在問(wèn)題是母牛的來(lái)源及系譜無(wú)法確定；其次，這類胚胎移植的受胎率低，應(yīng)用時(shí)應(yīng)慎重考慮。
    2、從活體母牛卵巢直接收集卵母細(xì)胞
    這種方法要借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡等直接由活體母牛的卵巢上吸取可用的卵母細(xì)胞。隨后的體外培養(yǎng)和受精過(guò)程與屠宰場(chǎng)獲取的卵巢卵母細(xì)胞相同。
    值得注意的是不管采用哪種方法生產(chǎn)的體外胚胎普遍存在活力較低，移植后產(chǎn)犢率低，胎兒初生重高，容易造成母牛難產(chǎn)等實(shí)際問(wèn)題。
  （三） 、胚胎切割
    胚胎切割是指運(yùn)用顯微鏡操作儀或其他簡(jiǎn)單設(shè)備將附植前的囊胚期胚胎分割為若干具有繼續(xù)發(fā)育潛能部分的技術(shù)，是提高胚胎利用率的有效方法之一。
    在進(jìn)行胚胎切割時(shí)為了便于操作和切割后的胚胎發(fā)育，一般選用發(fā)育到桑椹胚或囊胚最為適宜。一般借助微針或微刀對(duì)準(zhǔn)胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的部分進(jìn)行均等的直接下切，以保證切割后的部分有均等的發(fā)育能力。從理論上講胚胎的切割可能是無(wú)限的，但是實(shí)踐證明只有二分胚的發(fā)育能力最強(qiáng)。近幾年通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，二分胚直接移植的受胚率也可達(dá)40%以上，這無(wú)異是提高了胚胎利用率，但對(duì)這一技術(shù)仍需加強(qiáng)研究，簡(jiǎn)化操作，提高效率。
    五、胚胎的性別控制
    奶牛的性別控制是指采用某些人為的技術(shù)方法控制受精后胚胎性別，這是從根本上控制后代的性別比例，又稱性比控制。目前，人們將奶牛早期胚胎在移植前進(jìn)行性別鑒定，以達(dá)到按生產(chǎn)需要獲得單一性別犢牛的需要的方法也納入奶牛性別控制內(nèi)容。
    奶牛只有母牛產(chǎn)奶，一般情況下，非超群公、母牛所生的公犢生產(chǎn)價(jià)值極低。無(wú)論采用何種技術(shù)方法使奶牛多產(chǎn)母牛、少產(chǎn)公牛一直是人們長(zhǎng)期努力的目標(biāo)。一些方法雖然幾經(jīng)努力，但收效甚微。下面僅介紹兩種奶牛性別控制的方法，不久將對(duì)奶牛的性別控制發(fā)揮明顯作用。
     (一）、X和Y精子的分離
目前，X和Y精子的分離的準(zhǔn)確而有效的方法是流式細(xì)胞器分離。其理論根據(jù)是X精子是DNA的含量比Y精子高3-4%。具體的方法是：用特異的染料對(duì)精子進(jìn)行染色，隨后將精子連同少量稀釋液逐一通過(guò)流式細(xì)胞器的激光束，其探測(cè)器可感知精子染色后的發(fā)光強(qiáng)度并將這一信息傳遞給計(jì)算機(jī)，經(jīng)分辨后計(jì)算機(jī)令液晶充電器使發(fā)光較強(qiáng)的精子分離，進(jìn)入兩個(gè)不同的收集容器。這樣，正電荷收集器容器得到的是X精子，負(fù)電荷收集器容器則為Y精子。用分離后的精子進(jìn)行人工受精、體外受精或是顯微受精就可以得到單一性別率高的胚胎或犢牛。國(guó)外此法已開(kāi)始用于商業(yè)化的運(yùn)作，分離的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。每小時(shí)可得到一個(gè)輸精劑量的分離精子。存在的主要問(wèn)題是：流式細(xì)胞器的造價(jià)很高，投入大；分離的速度雖有較大提高，但也有下降趨勢(shì)。隨著這一技術(shù)的不斷改進(jìn)和提高，這一性別控制技術(shù)將給奶牛業(yè)帶來(lái)巨大效益和廣闊的應(yīng)用前景。
  （二）、SRY片段PCR擴(kuò)增胚胎性別鑒定法
    最近10年來(lái)發(fā)展的用公牛特異性DNA探針和PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增技術(shù)對(duì)奶牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定的一種準(zhǔn)確有效的方法。其主要操作步驟是：從被測(cè)胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用SRY基因的片段作引物，以所取的胚胎細(xì)胞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后用SRY特異探針對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。雄性胚胎顯示呈陽(yáng)性，雌性胚胎為陰性。也可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)SRY條帶的有無(wú)判斷胚胎為雄、雌。隨著這項(xiàng)技術(shù)的深入研究和進(jìn)展，目前只需幾個(gè)卵裂球即可完成檢測(cè)的取樣，減少了對(duì)胚胎的傷害。經(jīng)鑒定的胚胎，移植后產(chǎn)犢性別的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。
    此法整個(gè)操作只需幾十分鐘，有較好的應(yīng)用前景，已開(kāi)始了商業(yè)運(yùn)作。存在的主要問(wèn)題是需要實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)人員的技術(shù)水平較高，否則會(huì)有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，影響準(zhǔn)確率；其次，檢測(cè)試劑盒成本較高，無(wú)疑會(huì)增加被檢測(cè)胚胎的成本。

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