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實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)常用的器材一般包括玻璃器材、金屬器械、橡膠制品及塑料制品等，每類器材的處理及消毒措施都有不同。嚴(yán)格的消毒滅菌工作極為重要，直接影響著整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。消毒滅菌方法 1. 干熱滅菌法 2 濕熱滅菌法 3 射線滅菌法 4 過濾除菌法 5 化學(xué)消毒劑消毒法 6 抗生素抑菌法 不同種類物品及培養(yǎng)物的消毒滅菌方法 1 無菌操作室滅菌 2 培養(yǎng)液滅菌 3 玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌 4 培養(yǎng)材料的消毒滅菌
目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法(消毒劑、抗生素)兩大類。
是利用恒溫干燥箱內(nèi)120ºC～150ºC的高熱，并保持90～120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法。
主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。
酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一，在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時(shí)，常須利用工作臺(tái)面上的酒精燈火焰對(duì)金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。
壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前最常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。
適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和某些培養(yǎng)液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.0～1.1kg/cm2，維持20～30min即可達(dá)到滅菌效果。
利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對(duì)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。
適合于實(shí)驗(yàn)室空氣、地面、操作臺(tái)面滅菌。滅菌時(shí)間為30min。用紫外線殺菌時(shí)應(yīng)注意，不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，因?yàn)樽贤饩�不僅對(duì)人體皮膚有傷害，而且對(duì)培養(yǎng)物及一些試劑等也會(huì)產(chǎn)生不良影響。
是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)液等。
目前，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.22～0.45μm范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜，溶液通過濾膜后，細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過。
用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實(shí)驗(yàn)器皿等。
常用的化學(xué)消毒劑包括甲醛、高錳酸鉀、70%～75%乙醇、過氧乙酸、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環(huán)氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白粉等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的滅菌;利用甲醛加高錳酸鉀[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸法進(jìn)行無菌室和培養(yǎng)室的消毒。
在使用時(shí)應(yīng)注意安全，特別是用在皮膚或?qū)嶒?yàn)材料上的消毒劑，須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時(shí)間，才能達(dá)到安全和滅菌的目的。
主要用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。
培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)、觀察或更換培養(yǎng)液時(shí)，必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養(yǎng)液或容器，所以無菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。
由于無菌操作室的污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子，因此長期停用后的無菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌，熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2ml甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進(jìn)行無菌室的滅菌。
經(jīng)常使用的無菌操作室，在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔，并用紫外線燈照射30 min，進(jìn)行空氣滅菌。對(duì)超凈工作臺(tái)，每次操作前用紫外燈照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。
培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，或在24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。
目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌。或?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后在無菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后分裝備用。
使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí)，將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，增壓至0.35~0.4kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內(nèi)冷空氣，以便使蒸汽能到達(dá)各個(gè)消毒部位，保證消毒滅菌徹底。然后繼續(xù)加壓加熱，當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.0~1.1kg/cm2為121ºC，保持15~20 min即可。
由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長的消毒滅菌時(shí)間是必須的。
在121ºC的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌，因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121ºC。
消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)(表2-3)，時(shí)間不足達(dá)不到滅菌效果，時(shí)間過長培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)液成分。消毒滅菌結(jié)束后，關(guān)閉熱源，只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時(shí)才能打開放氣閥，排除剩余蒸汽，取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時(shí)打開放氣閥，引起減壓沸騰，使容器中液體溢出。
培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì)，則需用過濾方法消毒滅菌。
首先對(duì)培養(yǎng)液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場(chǎng)所，固體培養(yǎng)液在40ºC左右瓊脂即將凝結(jié)前，加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。
液體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液。過濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.22～0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行，所用器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌，溫度不應(yīng)超過121ºC。
玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后最好及時(shí)烘干水分。對(duì)不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在無菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)，用紫外線重復(fù)殺菌。
實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對(duì)塑料器皿進(jìn)行消毒，消毒后的器皿要充分散氣2～4小時(shí)后才可使用。無菌操作所用的各種器械，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌，或用75%酒精浸泡，然后在無菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)再用紫外線重復(fù)殺菌;在使用期間可多次對(duì)其進(jìn)行酒精燈火焰灼燒滅菌。
采自動(dòng)物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)材料，攜帶著微生物及雜質(zhì)，接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌，對(duì)內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。
從動(dòng)物機(jī)體采集的某些組織塊，須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理，進(jìn)行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫(10~12%，浸泡5~15min)、過氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2min)。
滅菌程序驗(yàn)證內(nèi)容
1.撰寫驗(yàn)證方案及制定評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。
2.確認(rèn)滅菌設(shè)備技術(shù)資料齊全、安裝正確，并能處于正常運(yùn)行。
3.確認(rèn)關(guān)鍵設(shè)備控制儀表在規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)能正常運(yùn)行。
4.采用被滅菌物品或模擬物品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)滅菌效果符合規(guī)定。
5.完善文件記錄，撰寫驗(yàn)證報(bào)告。
滅菌程序運(yùn)行監(jiān)控
1.關(guān)鍵參數(shù)應(yīng)在驗(yàn)證確定的范圍內(nèi)：溫度、壓力、時(shí)間、濕度、滅菌氣體濃度、輻照劑量等。
2.滅菌程序定期驗(yàn)證，時(shí)效不超過半年。
3.滅菌設(shè)備或程序發(fā)生變更重新進(jìn)行驗(yàn)證。
滅菌保證
1.滅菌效果與滅菌前產(chǎn)品污染程度及污染菌特性有關(guān)，把握微生物污染水平及污染菌耐受性，注意各個(gè)環(huán)節(jié)降低污染程度。
2.滅菌冷卻階段防止已滅菌物品再次污染。
3.適用生物指示劑、化學(xué)指示劑等監(jiān)控滅菌結(jié)果
生物指示劑
基本要求：
1.菌種的耐受性應(yīng)大于需滅菌產(chǎn)品中所有可能污染菌的耐受性。
2.菌種應(yīng)無致病性。
3.菌株應(yīng)穩(wěn)定，存活期長，易于保存。
4.易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，孢子含量在90%以上。
常用生物指示劑
1.濕熱滅菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（ATCC7953等，活孢子數(shù)為5×
105-5×106個(gè)/片)
2.干熱滅菌：枯草芽孢桿菌孢子（ATCC9372等，活孢子數(shù)為5×105-5×106個(gè)/片)
3.輻射滅菌：短小芽孢桿菌孢子（ATCC27142等，活孢子數(shù)為5×107-5×108個(gè)/片)
4.氣體滅菌：
（1）環(huán)氧乙烷滅菌：枯草芽孢桿菌孢子（ATCC9372等，活孢子數(shù)為5×105-5×106個(gè)/片)
（2）氣態(tài)過氧化氫滅菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（ATCC7953等，活孢子數(shù)為1×106-5×106個(gè)/片)
（3）過濾除菌法：缺陷假單胞菌（ATCC19146等）。
