引言:
阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)是一種周身無鞭毛,能運動,無芽孢的兼性厭氧菌,革蘭氏陰性桿菌。1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌。阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥,致死率可達40%~80%,自1961年首次由阪崎腸桿菌引起的新生兒腦膜炎之后,全球范圍陸續(xù)出現(xiàn)感染事件,丹麥、希臘、英國、荷蘭、冰島等國均有報道。其嚴重性已引起世界多國相關(guān)部門的重視,阪崎腸桿菌已被世界衛(wèi)生組織和許多國家確定為引起嬰兒死亡的重要條件致病菌。我國也于2005年5月20日通過了《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業(yè)標準,并于同年10月實施,我國《嬰兒配方食品》和《幼兒配方食品》相關(guān)標準規(guī)定嬰幼兒配方奶粉、食品中禁止檢出阪崎腸桿菌等致病菌。
一、阪崎桿菌的生物學特性
1 形態(tài)染色
阪崎腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬 , 因此本菌具備腸桿菌基本形態(tài)特征 : 革蘭陰性粗短桿菌,有周身菌毛 , 無芽胞, 有動力[1] 。
阪崎腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬 , 因此本菌具備腸桿菌基本形態(tài)特征 : 革蘭陰性粗短桿菌,有周身菌毛 , 無芽胞, 有動力[1] 。
2 培養(yǎng)特性
能在普通營養(yǎng)瓊脂、血平板、麥康凱(MAC) 瓊脂、伊紅美蘭 (EMB) 瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養(yǎng)基上生長繁殖。培養(yǎng)最佳溫度 25 ~ 36 ℃ , 在 6~ 45 ℃下都能生長 , 某些菌株可在 47 ℃下生長
[8] 。在胰蛋白胨瓊脂 (TSA) 、腦心浸液瓊脂(BH I) 及血平板上經(jīng) 25 ~ 36 ℃培養(yǎng) 24 h 后 , 形成 1. 5 ~ 2. 5mm, 黃色菌落。在結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂 (VRBG) 能產(chǎn)生紫紅色菌落[2]。
二、阪崎桿菌的傳統(tǒng)檢測方法
阪崎腸桿菌檢驗程序見圖 1。
1 基本步驟如下:
取檢樣100g(mL)加入已預熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中,用手緩緩地搖動至充分溶解,36℃±1℃培養(yǎng)18 h±2h。移取1mL轉(zhuǎn)種于10mL mLST-Vm肉湯,44℃±0.5 ℃培養(yǎng)24 h±2h。
輕輕混勻mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物,各取增菌培養(yǎng)物1環(huán),分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板,36℃±1℃培養(yǎng)18 h±2 h。
挑取1 個~5 個可疑菌落,劃線接種于TSA平板。25℃±1℃培養(yǎng)48 h±4 h。 自TSA 平板上直接挑取黃色可疑菌落,進行生化鑒定。阪崎腸桿菌的主要生化特征見表 1?蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。
2 結(jié)果與報告
綜合菌落形態(tài)和生化特征,報告每100g(mL)樣品中檢出或未檢出阪崎腸桿菌。
3 注意事項
(1)取樣前應對樣品包裝的開啟處和取樣勺進行消毒
(2)檢測樣品不能低于333g
三、檢測新技術(shù)簡介
1 熒光法選擇性培養(yǎng)基法
該方法也是利用α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法[3]。在營養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)上添加4 -甲基-傘形酮-α- D -葡萄糖苷 (α-MUG) 。阪崎腸桿菌在該培養(yǎng)基上形成黃色菌落 , 在紫外光照射下發(fā)生熒光。該法靈敏度和特異性都比較好 , 已在多個國家開展使用 , 均取得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。
2 對硝基酚光電比色法
利用阪崎腸桿菌的α-葡萄糖苷酶活性 , 分解對硝基酚-α- D -葡萄糖苷底物 , 釋放黃色的對硝基酚 , 在 405 nm 波長下測定吸光度 , 根據(jù)吸光度的大小 , 確定樣品中阪崎腸桿菌是否存在。方法是常規(guī)增菌 , 在 VRBG 或 TSA 平板上挑取可疑菌落 , 制備成一定濃度的菌懸液與底物混勻 , 37 ℃ 4 h 后進行比色測定[4]。
3 熒光定量 PCR 方法
熒光定量 PCR 技術(shù)的基本原理是在PCR 反應體系中加入熒光基團 , 該基團是一對合適的熒光物質(zhì) , 可以構(gòu)成一個能量供體和能量受體對 , 其中供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜重疊 , 在 PCR 反應基因擴增時 , 激發(fā)供體而釋放的熒光能量正好被受體吸收 , 使得供體的熒光強度減弱而受體熒光強度增強 , 利用熒光信號強弱變化積累實時監(jiān)測整個 PCR 反應過程 , 最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。
實時熒光定量 PCR 技術(shù)已廣泛應用于多種食品微生物污染的檢測。 SEO 等利用阪崎腸桿菌部分大分子合成(MMS) 操縱子基因序列建立了奶粉中阪崎腸桿菌的實時熒光定量 PCR 方法 , 能檢測到
0.6-1g 奶粉中的阪崎腸桿菌 , 且比傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測時間從 6 ~ 7 天縮短至 2 天內(nèi)完成。對 68株阪崎腸桿菌和 55 株非阪崎菌進行檢測 , 未出現(xiàn)假陽性和假陰性 , 具有很好的特異性。
結(jié)語:
傳統(tǒng)的檢測方法存在操作繁瑣,時間長等缺點,很難滿足現(xiàn)代臨床快速診斷和治療的需求。要了解更準確,快速,簡便,可靠的方法和技術(shù),科學為此已作了大量的研究,試驗方法和識別技術(shù)正在不斷發(fā)展和完善,并在實踐中不斷取得新的進展。