由于食品的種類不同,其中脂肪含量及其存在形式也不相同,測定脂肪的方法也就不同。
常用的測定方法有:
(1)索式提取法 (2)巴布科克法 (3)益勒式法 (4)羅斯-哥特里法(5)酸分解法
過去測定脂肪普遍采用的是索式提取法,這種方法至今仍被認為是測定多種食品脂類含量的代表性的方法,但對于某些樣品測定結(jié)果往往偏低,而巴布科克法、益勒式法、羅斯-哥特里法主要用于乳、及乳制品中脂類的測定,而酸水解法測出的脂肪為游離態(tài)脂和結(jié)合脂全部脂類。
一、 索式提取法(經(jīng)典方法)
1、 原理
樣品經(jīng)前處理后,放入圓筒濾紙內(nèi),將濾紙筒置于索式提取管中,利用乙醚或石油醚在水浴中加熱回流,使樣品中的脂肪進入溶劑中,回收溶劑后所得到的殘留物,即為脂肪(粗脂肪)
采用這種方法測出游離態(tài)脂,此外還含有磷脂、色素、蠟狀物、揮發(fā)油、糖脂等物質(zhì),所以用索氏提取法測得的脂肪為粗脂肪。
2、 適用范圍與特點
索氏提取法適用于脂類含量較高,結(jié)合態(tài)的脂類含量較少,能烘干磨細,不宜吸濕結(jié)塊的樣品的測定。
此法只能測定游離態(tài)脂肪,而結(jié)合態(tài)脂肪無法測出,要想測出結(jié)合態(tài)脂肪需在一定條件下水解后變成為游離態(tài)的脂肪方能測出。
另外此法是經(jīng)典方法,對大多數(shù)樣品結(jié)果比較可靠,但需要周期長,溶劑量大。
3、 方法
(1) 濾紙筒的制備
將濾紙剪成長方形8×15cm ,卷成圓筒,直徑為6cm,將圓筒底部封好,最好放一些脫脂棉,避免向外漏樣。
(2) 稱取樣品,將樣品烘干磨細,稱取一定量與紙筒封好上口,最好用測定水的樣品。
(3) 索式抽提器的準備
索氏抽提器由三部分組成,回流冷凝管、提取管、提脂瓶組成。提脂瓶在使用前需烘干并稱至恒重。其它要干燥。
(4) 抽提
將裝好樣的紙筒放入抽提管 , 倒入乙醚,乙醚的量從提取管加入,加入的量為提取瓶體積的2/3 接上冷凝裝置,在恒溫水浴中抽提,水浴溫度大約為55℃左右,可用濾紙檢驗,理論值抽提6-8小時,實際值3-4小時,但也根據(jù)樣品性質(zhì)來決定。
(5) 回收乙醚
當乙醚在提取管內(nèi)即將虹吸時立即取下提取管,將其下口放到乙醚回收瓶內(nèi),使之傾斜,然后將提取瓶放到100-150℃烘箱烘至恒重。
(6) 計算
脂肪%= (W2-W1)/W x 100
W2——瓶和樣品重(g)W1——瓶子重量(g) W——樣品重量(g)
或:
脂肪%=(抽提后濾紙與樣品重量—抽提前濾紙重量)/樣品重量 × 100
濾紙筒應(yīng)事先放入燒杯與100-105℃烘箱烘至恒重。
3、注意事項:
(1)樣品應(yīng)干燥后研細,裝樣品的濾紙筒一定要緊密,不能往外漏樣品,否則重做。
(2)放入濾紙筒的高度不能超過回流彎管,否則乙醚不易穿透樣品,使脂肪不能全部提出,造成誤差。
(3) 碰到含多糖及糊精的樣品要先以冷水處理,等其干燥后連同濾紙一起放入提取器內(nèi)。
(4) 提取時水浴溫度不能過高,一般使乙醚剛開始沸騰即可(約45℃左右),回流速度以8-12次/時為宜。
(5) 所用乙醚必需是無水乙醚,如含有水分則可能將樣品中的糖以及無機物抽出,造成誤差。
(6) 若用干樣品測定脂肪,可按下式計算原來樣品脂肪的含量
脂肪(%)= (W1-W2)(100-A) / W
A— 100克樣品中水分的含量(g)
(7) 冷凝管上端最好連接一個氯化鈣干燥管,這樣不僅可以防止空氣中水分進入,而且還可以避免乙醚揮發(fā)在空氣中。這樣可防止實驗室微小環(huán)境空氣的污染,如無此裝置,塞一團干脫脂棉球亦可。
(8)如果沒有無水乙醚可以自己制備,制備方法如下:在100ml乙醚中,加入無水石膏50克,振搖數(shù)次,靜止10小時以上,蒸餾,收集35℃以下的蒸餾液,即可應(yīng)用。
(9)將提取瓶放在烘箱內(nèi)干燥時,瓶口向一側(cè)傾斜45度防止揮發(fā)物乙醚易與空氣形成對流,這樣干燥迅速。
(10)如果沒有乙醚或無水乙醇時,可以用石油醚提取,石油醚沸點30-60℃為好。
(11)使用揮發(fā)乙醚或石油醚時,切忌直接用火源加熱,應(yīng)用電熱套、電水浴、電燈泡等。
(12) 這里恒重的概念有區(qū)別,它表示最初達到的最低重量,即溶劑和水分完全揮發(fā)時的恒重,此后若在繼續(xù)加熱,則因油脂氧化等原因會導致重量增加。
(13) 在干燥器中的冷卻時間一般要一致。
二、 巴布科克法(Babcock 法)
巴布科克法是用來測定乳及乳制品的一種方法,測定牛奶前我們首先搞清牛奶的營養(yǎng)成分。
牛奶的平均成分:
牛乳100%:水分87.5%,總固體12.2%,維生素,免疫體和酶;
總固體12.2%:非脂固體8.8%,乳脂肪3.4%;
非脂固體8.8%:蛋白質(zhì)3.5%,乳糖4.6%,礦物質(zhì)Ca.p.Fe.K等;
蛋白質(zhì)3.5%:酪蛋白3.0%,白蛋白0.4%,球蛋白0.1%。
在成分表中乳脂肪3.4%是需要我們檢測。在牛乳中蛋白質(zhì)比人乳蛋白質(zhì)高。乳糖含量比人乳少,礦物質(zhì)中Ca 的含量比人乳多,而Fe的含量比人乳少。
牛乳中脂肪含量標準如下
生鮮牛乳:
(1)特級≥ 3.2%
(2)一級≥ 3.0%
(3)二級≥ 2.8%
消毒牛乳≥ 3.0 %
眾所周知牛乳是乳濁液。它的脂類在牛乳中并不是以溶解狀態(tài)存在,而是以脂肪球呈乳濁液狀態(tài)存在,在它周圍有一層膜,這層膜使脂肪球得以在乳中保持乳濁液的穩(wěn)定狀態(tài),這層膜其中含蛋白質(zhì)。磷脂等許多物質(zhì),通常用濃H2SO4時非脂成分溶解,脂肪球膜就被軟化破壞,于是乳濁液就破壞,脂肪即可分離出來,這是公認的標準分析法。
巴布科克法和蓋勃氏法這兩種方法是有兩個科學家研制出來,一個是美國的Babcock在1890年研究出測牛乳的脂肪,后來經(jīng)過2年,即1892年由英國的蓋勃液研究出測牛乳的脂肪。
這兩種方法都是用來提取乳制品中的脂肪,此法也叫濕法提取,因為樣品不需要事先烘干,脂肪在牛乳中以乳膠體形式存在,要測定脂肪必需要破壞乳膠體脂肪與其它非脂成分分離,分離出來的非脂成分一般用濃H2SO4分解,用容量法定量,操作簡便,為許多國家用于乳制品的常規(guī)分析。
Babcock法 原理
利用硫酸溶解乳中的乳糖浴蛋白質(zhì)等非脂成分使脂肪球膜破壞,脂肪游離出來,在乳脂瓶中直接讀取脂肪層,從而迅速求出被檢乳中的脂肪率。
2、方法
準確吸取17.6ml牛乳 → 于乳脂瓶中 → 加17.5ml硫酸(用量筒量。 混合 → 離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分) →60℃水至瓶頸 → 離心2分鐘(1000轉(zhuǎn)/分) → 加60℃水至4%刻度線 →離心1分鐘 → 60℃水浴中 →使脂肪柱穩(wěn)定 → 讀取
加H2SO4的作用:
(1)溶解蛋白質(zhì)
(2)乳解乳糖
(3)減少脂肪的吸附力
因為非脂成分溶解在H2SO4中,這樣就增加了消化液的比重(H2SO4比重1.820-1.825,脂肪比重小于1),即比重大于1.820-1.825,脂肪的比重小于1的,這樣就使得脂肪迅速而完全地與非脂沉淀,另外離心的作用是脂肪非常清晰的分離,加熱的目的,使脂肪吸附力降低,上浮速度加快,這就是采用Babcock法測牛乳脂肪。
近來在有些科技書中,將Babcock法加以改進,用來測肉制品和谷物類樣品。
因為Babcock法用濃硫酸作為蛋白質(zhì)的溶解劑,對測肉制品會發(fā)生炭化,這些碳化物懸浮在脂肪層和水層的界面間,這樣造成了讀數(shù)不準確,因此,他們研究了各種代替硫酸的試劑,后來他們認為利用高氯酸-醋酸混合液代替硫酸,測定肉及肉制品的脂肪,測定值與AOAC法一致,精密度以標準偏差表示為0.2%。
所用試劑:
高氯酸-醋酸混合液
6%的高氯酸與等容量的醋酸混合。
具體方法:
稱9克絞碎的肉 ,于巴氏瓶中 ,加混合酸30m ,于沸水浴中加熱15min(使樣品充分溶解), 在加混合酸 ,使之達到瓶子的刻度范圍
離心2min (1000轉(zhuǎn)/分) 60℃水浴10min 讀取
計算: Fat% = H x 0.95
H—讀取脂肪柱的數(shù)值
0.95—溶解于脂肪層中的醋酸修正值
改良的巴布科克法:對溶質(zhì)品質(zhì)類經(jīng)過加熱的試樣,水浴中加熱15min即可完全溶解,對于生肉試樣由于沒發(fā)生熱變性 ,采用混合酸后,肉蛋白質(zhì)在一定時間內(nèi)凝固,溶解的時間大約需要25分鐘。
三、Gerber法(蓋勃氏法)
這種方法對糖分高的樣品,如采用此方法容易焦化,致使結(jié)果誤差大,故不適宜。
1、 原理:
在牛乳中加硫酸,可破壞牛乳的膠質(zhì)性,使牛乳中的酪蛋白鈣鹽變成可溶性的重硫酸酪蛋白化合物,并且能減小脂肪球的吸附力,同時還可增加消化液的比重使脂肪更容易浮出液面,在操作中還需要加入異戊醇,降低脂肪球的表面張力,促進脂肪球的離析,但是異戊醇的溶解度很小,所以在操作中,不能加的太多,如果加的太多,異戊醇會進入脂肪中,使脂肪體積增大,而且會有一部分異戊醇和硫酸作用生成硫酸脂,反應(yīng)如下:
2C5H11OH + H2SO4 → (C5H11O)2SO2 + 2H2O
在操作過程中加熱65-70℃和離心處理,目的都使脂肪酸迅速而徹底分離。
2、 方法
取10ml H2SO4于乳脂瓶中--準確量取11.0ml牛乳--加1ml異戊醇 --混合--65℃水浴5min
離心5min (1000轉(zhuǎn)/分) --65℃水浴5min---立即讀取
說明:
(1) 在巴氏法中采用17.6ml吸管,實際上注入巴氏瓶中只有17.5ml,牛乳的比重1.030g/ml,故樣品質(zhì)量為
17.5 x 1.030 = 18g
巴氏瓶的刻度共10大格(0-10%),每大格容積為0.2ml,脂肪的平均比重為0.9,其脂肪質(zhì)量為 0.2 x 10(10大格)x0.9 (脂肪比重)= 1.8(g),18g 樣品中含1.8g脂肪即瓶頸全部刻度表示的脂肪含量10%,每一大格代表1% 的脂肪,故巴氏瓶頸刻度讀數(shù)即直接為脂肪的百分含量。
(2)硫酸濃度及用量要嚴格遵守方法中規(guī)定的要求,硫酸濃度過大會使牛乳炭化成黑色溶液而影響讀數(shù);濃度過小則不能氏酪蛋白完全溶解,會使測定值偏低或使脂肪層渾濁。