色譜定量分析,顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量,主要分為面積百分比法、歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準加入法,色譜定量分析首先需要明確的概念是響應(yīng)因子,不同的化合物在檢測器的響應(yīng)是不一樣的,簡單地舉個例子說,相同濃度的化合物A和B,相同的進樣量,得到的峰高和峰面積不一定一樣的,響應(yīng)因子的計算式如下:
式中,w為化合物的含量,A為響應(yīng)值,一般為峰面積或峰高,以峰面積為例。
由于不同的化合物在同一個檢測器的響應(yīng)因子不同,甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應(yīng)因子不同,簡單地說就是化合物在檢測器的響應(yīng)不呈線性,或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時,除需要考慮是相對定量還是絕對定量外,同時需要考察化合物的線性響應(yīng)范圍、是否有合適內(nèi)標(biāo)、是否有標(biāo)準品等。接下來小編就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法:面積歸一化法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。
歸一化法
由于組分的量與其峰面積成正比,如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號,得到相應(yīng)的色譜峰,那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。
若樣品中各組分的校正因子相近,可將校正因子消去,直接用峰面積歸一化進行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。
優(yōu)/缺點
優(yōu)點:簡便、準確、定量結(jié)果與進樣量重復(fù)性無關(guān)(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時對結(jié)果影響較小。
缺點:必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出色譜柱,而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。
外標(biāo)法
用待測組分的純品作對照物質(zhì),以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點法等。
工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線,求出斜率、截距。在完全相同的條件下,準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液,根據(jù)待測組分的信號,從標(biāo)準曲線上查出其濃度,或用回歸方程計算,工作曲線法也可以用外標(biāo)二點法代替。通常截距應(yīng)為零,若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時,可用外標(biāo)一點法(直接比較法)定量。
外標(biāo)一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣,測得峰面積的平均值,用下式計算樣品中i組分的量:
Wi=AiWs/As
式中Wi與Ai分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。Ws及As分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。
優(yōu)/缺點
優(yōu)點:簡便,不需用校正因子,不論樣品中其他組分是否出峰,均可對待測組分定量。
缺點:此法的準確性受進樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。
此外,為了降低外標(biāo)一點法的實驗誤差,應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。
內(nèi)標(biāo)法
選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對照物質(zhì)加入待測樣品溶液中,以待測組分和對照物質(zhì)的響應(yīng)信號對比,測定待測組分含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。“內(nèi)標(biāo)”的由來是因為標(biāo)準(對照)物質(zhì)加入到樣品中,有別于外標(biāo)法。該對照物質(zhì)稱為內(nèi)標(biāo)物。
在一個分析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分),或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號,或只需測定混合物中某幾個組分的含量時,可采用內(nèi)標(biāo)法。
準確稱量W克樣品,再準確稱量Ws克內(nèi)標(biāo)物,加入至樣品中,混勻,進樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內(nèi)標(biāo)物的峰面積As,則i組分在W克樣品中所含的重量Wi,與內(nèi)標(biāo)物的重量Wi,有下述關(guān)系:
待測組分i在樣品中的百分含量Ci%為:
對內(nèi)標(biāo)物的要求:
①內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分,否則會使峰重疊而無法準確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積;
②內(nèi)標(biāo)物的保留時間應(yīng)與待測組分相近,但彼此能完全分離(R≥1.5);
③內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。
優(yōu)/缺點
優(yōu)點:①在進樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi),定量結(jié)果與進樣量的重復(fù)性無關(guān)。②只要被測組分及內(nèi)標(biāo)物出峰,且分離度合乎要求,就可定量,與其他組分是否出峰無關(guān)。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊,無法用歸一化法測定含量,用內(nèi)標(biāo)法則很方便。
缺點:加一個與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進樣量突出雜質(zhì)峰,測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比,即可求出雜質(zhì)含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標(biāo)物不易找尋。
峰面積百分比法
峰面積百分比法也是相對定量,忽略各個組分的響應(yīng)因子或者默認為每個組分的響應(yīng)因子相同,計算如下式:
峰面積百分比法適合于不需要準確定量,同時難以得到響應(yīng)因子的情況。
標(biāo)準加入法
標(biāo)準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法,是以待測組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo),加入到待測樣品中,然后在相同的色譜條件下,測定加入前后待測組分的峰面積(或峰高),從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計算方法為例,標(biāo)準加入法的計算如下:
式中,Δwi為加入的標(biāo)準品的量,Ai為待測組分的峰面積,ΔAi為加入標(biāo)準品后待測組分峰面積的增加量,wi為原樣品中待測組分的含量。
無論是何種定量計算方法都各有優(yōu)缺點,沒有一種方法是一勞永逸,還應(yīng)該根據(jù)樣品情況,具體情況具體選擇。
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式中,w為化合物的含量,A為響應(yīng)值,一般為峰面積或峰高,以峰面積為例。
由于不同的化合物在同一個檢測器的響應(yīng)因子不同,甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應(yīng)因子不同,簡單地說就是化合物在檢測器的響應(yīng)不呈線性,或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時,除需要考慮是相對定量還是絕對定量外,同時需要考察化合物的線性響應(yīng)范圍、是否有合適內(nèi)標(biāo)、是否有標(biāo)準品等。接下來小編就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法:面積歸一化法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。
歸一化法
由于組分的量與其峰面積成正比,如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號,得到相應(yīng)的色譜峰,那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。
若樣品中各組分的校正因子相近,可將校正因子消去,直接用峰面積歸一化進行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。
優(yōu)/缺點
優(yōu)點:簡便、準確、定量結(jié)果與進樣量重復(fù)性無關(guān)(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時對結(jié)果影響較小。
缺點:必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出色譜柱,而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。
外標(biāo)法
用待測組分的純品作對照物質(zhì),以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點法等。
工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線,求出斜率、截距。在完全相同的條件下,準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液,根據(jù)待測組分的信號,從標(biāo)準曲線上查出其濃度,或用回歸方程計算,工作曲線法也可以用外標(biāo)二點法代替。通常截距應(yīng)為零,若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時,可用外標(biāo)一點法(直接比較法)定量。
外標(biāo)一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣,測得峰面積的平均值,用下式計算樣品中i組分的量:
Wi=AiWs/As
式中Wi與Ai分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。Ws及As分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。
優(yōu)/缺點
優(yōu)點:簡便,不需用校正因子,不論樣品中其他組分是否出峰,均可對待測組分定量。
缺點:此法的準確性受進樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。
此外,為了降低外標(biāo)一點法的實驗誤差,應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。
內(nèi)標(biāo)法
選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對照物質(zhì)加入待測樣品溶液中,以待測組分和對照物質(zhì)的響應(yīng)信號對比,測定待測組分含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。“內(nèi)標(biāo)”的由來是因為標(biāo)準(對照)物質(zhì)加入到樣品中,有別于外標(biāo)法。該對照物質(zhì)稱為內(nèi)標(biāo)物。
在一個分析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分),或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號,或只需測定混合物中某幾個組分的含量時,可采用內(nèi)標(biāo)法。
準確稱量W克樣品,再準確稱量Ws克內(nèi)標(biāo)物,加入至樣品中,混勻,進樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內(nèi)標(biāo)物的峰面積As,則i組分在W克樣品中所含的重量Wi,與內(nèi)標(biāo)物的重量Wi,有下述關(guān)系:
待測組分i在樣品中的百分含量Ci%為:
對內(nèi)標(biāo)物的要求:
①內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分,否則會使峰重疊而無法準確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積;
②內(nèi)標(biāo)物的保留時間應(yīng)與待測組分相近,但彼此能完全分離(R≥1.5);
③內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。
優(yōu)/缺點
優(yōu)點:①在進樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi),定量結(jié)果與進樣量的重復(fù)性無關(guān)。②只要被測組分及內(nèi)標(biāo)物出峰,且分離度合乎要求,就可定量,與其他組分是否出峰無關(guān)。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊,無法用歸一化法測定含量,用內(nèi)標(biāo)法則很方便。
缺點:加一個與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進樣量突出雜質(zhì)峰,測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比,即可求出雜質(zhì)含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標(biāo)物不易找尋。
峰面積百分比法
峰面積百分比法也是相對定量,忽略各個組分的響應(yīng)因子或者默認為每個組分的響應(yīng)因子相同,計算如下式:
峰面積百分比法適合于不需要準確定量,同時難以得到響應(yīng)因子的情況。
標(biāo)準加入法
標(biāo)準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法,是以待測組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo),加入到待測樣品中,然后在相同的色譜條件下,測定加入前后待測組分的峰面積(或峰高),從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計算方法為例,標(biāo)準加入法的計算如下:
式中,Δwi為加入的標(biāo)準品的量,Ai為待測組分的峰面積,ΔAi為加入標(biāo)準品后待測組分峰面積的增加量,wi為原樣品中待測組分的含量。
無論是何種定量計算方法都各有優(yōu)缺點,沒有一種方法是一勞永逸,還應(yīng)該根據(jù)樣品情況,具體情況具體選擇。
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