原理
向樣品中加入濃硫酸和催化劑,充分混勻,然后加熱消化分解,樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水,其中的有機氮轉化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),即為蛋白質(zhì)的含量。
樣品消化
濃硫酸具有脫水性和氧化性,可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水,蛋白質(zhì)會分解為氨,然后氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質(zhì)分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點,一般情況下,純硫酸的沸點在340℃左右,但是在添加硫酸鉀后,可提高至400℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀,否則會因為溫度過高,使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外,還可以指示消化終點的到達,有機物全部消化完全后,溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色,硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。
蒸餾
消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出,影響測定結果,所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽,需要足夠的堿液使結合態(tài)的氨完全反應并釋放出來,這個過程中的氫氧化鈉一定要過量,過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀,氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成,可用奈氏試紙法,NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收,硼酸有吸收氨的作用,又因其呈微弱酸性,不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱,從而造成損失,故一般不超過40 ℃。
滴定
待吸收完全后,用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定,滴定液的濃度直接影響結果的準確性,必須按照要求進行配制和標定;旌现甘緞┰谥行匀芤褐谐驶疑味ńK點時液體呈灰色。
①所用的試劑溶液應用無氨蒸餾水配制;
②取樣應具有代表性,取樣前將樣品充分混勻;
③樣品稱量放入凱氏燒瓶時,切勿使樣品粘附在瓶頸部,避免樣品未消化完全而造成氮損失;
④為了保證使燒瓶壁上的殘渣消化完全,在消化過程中要不時地轉動凱氏燒瓶;
⑤消化脂肪或糖含量較高的樣品時,易產(chǎn)生大量泡沫,為防止泡沫溢出,消化時應先消化加熱并不斷搖動,或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑;
⑥當樣品消化液渾濁或未澄清透明時,可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后,再加入30%的過氧化氫,然后繼續(xù)加熱消化;
⑦加堿后,漏斗要進行水封,避免因裝置漏氣造成氨的逸出影響結果的準確性;
⑧要保證蒸餾裝置不能漏氣;
⑨在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差,蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時,要保證蒸汽均勻、充足,中間不能停止加熱,防止發(fā)生倒吸;
⑩蒸餾前如果加堿后消化液呈藍色而沒有生成氫氧化銅沉淀,說明加入的堿量不足,需要適量補加堿;,蒸餾時為防止水蒸氣發(fā)生器內(nèi)液體爆沸,加入幾片碎瓷片或大的玻璃珠,玻璃珠直徑最好大于聯(lián)通的玻璃管直徑,以免玻璃珠進入玻璃管內(nèi)影響蒸汽均勻、充足的輸出; -冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下,防止氨逸出,蒸餾完畢后先將冷凝管下端提離液面,再蒸1min后清洗管口,再移開吸收瓶,最后關掉熱源,否則可能發(fā)生倒吸。
常見問題解答
一、消化過程中容易沾壁怎么辦?消化后定氮瓶內(nèi)有黑色殘留物怎么辦?
解答:稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部,避免因樣品未消化完全而造成結果偏低。消化過程中如果發(fā)生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物,可以在消化較完全時搖動定氮瓶,把定氮瓶肚上的黑色物質(zhì)搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗,戴上防燙手套,手掌緊握瓶頸,向前后側甩,使瓶內(nèi)液體呈半旋轉半振蕩狀態(tài),注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎?
解答:硫酸鉀的作用是提高溶液沸點,從而加快有機物分解。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑?
解答:硫酸銅的作用有三個,分別為:
①催化作用:加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑:使液體呈現(xiàn)藍綠色澄清透明狀態(tài)。
③蒸餾時堿性反應的指示劑:產(chǎn)生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎?
解答:混合指示劑必須臨用時混合。
五、蒸餾的時取下錐形瓶需要用洗瓶沖洗嗎?不沖洗會有誤差嗎?
解答:需要沖洗冷凝管下端以防止產(chǎn)生結果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作?
解答:可以將蒸餾裝置連接好后,在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水,打開電爐加熱,觀察有無氣泡產(chǎn)生
七、硼酸可以多加嗎?
解答:不可以。按國標的要求正確操作,10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液,能否換濃度高的鹽酸溶液滴定?
解答:不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質(zhì)含量較高的樣品可以適當減少稱樣量,或合理范圍內(nèi)減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什么?
解答:試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎么換算?
解答:同時含有多種蛋白質(zhì),且折算系數(shù)不相同時可以按復合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。
結語:凱氏定氮法經(jīng)典、準確,適用于食品中蛋白質(zhì)的測定。但是因樣品中一般會含有一些非蛋白質(zhì)的含氮化合物,所以凱氏定氮法測定結果為樣品中粗蛋白質(zhì)含量。然而,此法實際上測的不是蛋白質(zhì)含量,而是通過測氮含量來推算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。在凱氏定氮法中消化操作的條件是產(chǎn)生誤差的主要原因,因此要格外注意。在實際的生產(chǎn)實驗中,每一步應該嚴格按照標準的規(guī)定來進行操作。本文為筆者日常工作實驗總結所得,望對實驗者有些許幫助。
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