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前沿科技| 氨甲酰磷酸不同合成途徑在大腸桿菌中的比較

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-10-23
核心提示:氨甲酰磷酸的合成具有極為重要的意義,本研究以大腸桿菌為材料,建立了細(xì)胞水平的氨甲酰磷酸檢測(cè)體系。在此基礎(chǔ)上,對(duì)氨甲酰磷酸
 氨甲酰磷酸的合成具有極為重要的意義,本研究以大腸桿菌為材料,建立了細(xì)胞水平的氨甲酰磷酸檢測(cè)體系。在此基礎(chǔ)上,對(duì)氨甲酰磷酸合成的CPS Ⅱ途徑與CK途徑在全細(xì)胞催化水平進(jìn)行了相應(yīng)的比較和優(yōu)化。優(yōu)化后的CPS Ⅱ途徑合成氨甲酰磷酸的能力優(yōu)于CK途徑,這為相關(guān)高附加值化合物的合成提供了一種更加高效的策略。

1、背景


氨甲酰磷酸是生物合成代謝中精氨酸與嘧啶的重要前體物質(zhì),在工業(yè)微生物生產(chǎn)精氨酸與嘧啶及其衍生物中發(fā)揮關(guān)鍵作用。


2、目的

在大腸桿菌Escherichia coli BW25113中比較氨甲酰磷酸不同合成途徑的催化效率。


3、方法

在大腸桿菌Escherichia coli BW25113中過(guò)表達(dá)鳥(niǎo)氨酸氨甲;D(zhuǎn)移酶(OTC)的基礎(chǔ)上,分別過(guò)表達(dá)大腸桿菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPS Ⅱ)并表征其反應(yīng)效果。通過(guò)優(yōu)化底物供應(yīng)(調(diào)整底物濃度與引入L-谷氨酰胺合成酶)對(duì)CK與CPS Ⅱ的催化反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。


4、結(jié)果

在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)OTC,建立細(xì)胞水平氨甲酰磷酸檢測(cè)體系。在此基礎(chǔ)上比較不同來(lái)源的CK,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌來(lái)源的CK效果最好,50 mmol/L NH4HCO3條件下全細(xì)胞催化9 h得到2.95±0.15 mmol/L L-瓜氨酸;過(guò)表達(dá)CPS Ⅱ時(shí),50 mmol/L L-谷氨酰胺催化9 h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通過(guò)改變底物NH4HCO3濃度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式對(duì)CK與CPS Ⅱ的催化反應(yīng)分別進(jìn)行優(yōu)化后,100 mmol/L NH4HCO3條件下,L-瓜氨酸濃度分別提高至4.67±0.55 mmol/L和6.12±0.38 mmol/L,且過(guò)表達(dá)GS后CPS Ⅱ途徑可以利用NH3,不需要額外添加L-谷氨酰胺。


5、結(jié)論

【結(jié)論】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPS Ⅱ途徑合成氨甲酰磷酸的能力優(yōu)于CK途徑,為精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一種更加高效的策略。

圖1  氨甲酰磷酸的不同合成途徑與L-瓜氨酸合成途徑

Figure 1  Different carbamoyl phosphate synthetic pathways and L-citrulline synthetic pathway

 


圖2  SDS-PAGE分析不同來(lái)源CK的蛋白表達(dá)(A)與催化能力比較(B)

Figure 2 SDS-PAGE analysis of expressions of CKs from different species (A) and comparison of catalytic capacity of CKs (B)


圖3  SDS-PAGE分析CPS Ⅱ的蛋白表達(dá)(A)與催化效果(B)

Figure 3  SDS-PAGE analysis of expression of CPS Ⅱ (A) and catalytic effect (B)

 

 


圖4  NH4HCO3濃度對(duì)菌株ECFI合成氨甲酰磷酸的影響

Figure 4 Effects of different concentrations of NH4HCO3 on synthesizing carbamoyl phosphate by strain ECFI

圖5  引入兩岐雙岐桿菌來(lái)源GS對(duì)CPS Ⅱ途徑的影響(A),以及降低L-谷氨酰胺添加量對(duì)菌株GSABFI的影響(B)

Figure 5 The effect on CPS Ⅱ synthesis with the introduction of GS from Bifidobacterium bifidum (A), and the effect of reducing the amount of L-glutamine on the strain GSABFI (B)

圖6  兩種合成氨甲酰磷酸途徑的比較

Figure 6  Comparison of two carbamoyl phosphate biosynthesis pathways


 


編輯:songjiajie2010

 
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