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乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-08-29  來源:食品科學(xué)雜志
核心提示:嗜酸乳桿菌是重要的益生菌,被大量應(yīng)用在食品中。研究表明嗜酸乳桿菌能在乳制品中產(chǎn)生乳酸,并能通過氨基酸代謝增加風(fēng)味。嗜酸乳
嗜酸乳桿菌是重要的益生菌,被大量應(yīng)用在食品中。研究表明嗜酸乳桿菌能在乳制品中產(chǎn)生乳酸,并能通過氨基酸代謝增加風(fēng)味。嗜酸乳桿菌主要作用有降低pH值、產(chǎn)生抗菌素(如嗜酸菌素和乳酸殺菌素等),在一定程度上抑制腸道中有害微生物的有害作用。有研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌對(duì)大腸桿菌、腹瀉致病菌等均有抑制作用;大量的嗜酸乳桿菌還可阻礙膽固醇的合成,降低血漿中膽固醇含量;另外對(duì)于乳糖不耐癥也有一定的療效。嗜酸乳桿菌對(duì)腸道菌群的平衡和對(duì)微生態(tài)的調(diào)節(jié)也證明其對(duì)健康具有促進(jìn)的作用。


目前在DNA水平上的分子檢測(cè)方法越來越多,其檢測(cè)方法快速方便、靈敏、省時(shí)被廣泛應(yīng)用到物種檢測(cè)中。其中實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)因其高特異性、高靈敏度、無污染等優(yōu)點(diǎn),在食品檢測(cè)中備受青睞。上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(上海)的張娜娜、劉 洋*、俞 漪等人建立基于嗜酸乳桿菌SPIDR保守區(qū)域的序列結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量檢測(cè)飲料中的嗜酸乳桿菌,以保障食品安全監(jiān)管順利進(jìn)行。



1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性

所有嗜酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯擴(kuò)增,且Ct值在16~18之間,其他菌株均無明顯的擴(kuò)增;采用乳桿菌通用引物對(duì)所有菌株進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),可見到清晰的擴(kuò)增條目。證明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)于嗜酸乳桿菌有較好的特異性。

2.檢測(cè)方法的靈敏度

①實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的絕對(duì)靈敏度

嗜酸乳桿菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可穩(wěn)定檢測(cè)的最低質(zhì)量濃度為0.00058ng/μL。每個(gè)模板添加4μL,即檢測(cè)限在3pg左右,本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的絕對(duì)靈敏度達(dá)到3pg。


②實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相對(duì)靈敏度

嗜酸乳桿菌ATCC4356的絕對(duì)靈敏度可穩(wěn)定檢出的最低濃度為103 CFU/mL。根據(jù)絕對(duì)靈敏度和相對(duì)靈敏度的檢測(cè)可得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)限為103CFU/mL。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

 

嗜酸乳桿菌ATCC4356不同的核酸濃度擴(kuò)增,每個(gè)質(zhì)量濃度6個(gè)平行,最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值的SD介于0.14~0.56之間,RSD介于0.862%~2.55%之間,均在可接受范圍內(nèi)。證明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性較好。



4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的抗干擾能力

在樣品中混入103、106CFU/mL的雜菌對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增是沒有干擾的,且檢出限仍為103CFU/mL;在不同濃度的嗜酸乳桿菌ATCC4356的核酸中添加300pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922的核酸提取物,各濃度梯度核酸檢出的Ct值均未受影響,證明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系抗干擾能力強(qiáng)。

5.模擬樣品的檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲

 

為驗(yàn)證建立的方法是否可以在實(shí)際樣品中進(jìn)行檢測(cè),在進(jìn)行實(shí)樣檢測(cè)之前,利用模擬樣品對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。這樣不僅可以節(jié)約時(shí)間,且節(jié)省成本在不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料為基質(zhì)的模擬樣品檢測(cè)中,以Ct值為縱坐標(biāo),以嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株已知的不同稀釋菌數(shù)對(duì)數(shù)Lg(CFU/g)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程為y=-3.312 4x+38.939,

R2=0.987,檢測(cè)結(jié)果的線性較好且檢測(cè)限仍為103CFU/mL。


6.實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

11份樣品中,6份樣品檢測(cè)出含有嗜酸乳桿菌,編號(hào)分別為B1、B4、B6、B7、B8、B9,這與購買樣品的便簽信息一致。檢測(cè)結(jié)果可以看出,嗜酸乳桿菌的含量在5.83×102~3.68×104 CFU/mL之間,建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以用砸乳酸菌飲料中對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量。

討論與結(jié)論

本研究利用設(shè)計(jì)的嗜酸乳桿菌屬的特異性引物建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在乳酸菌飲料中的檢測(cè)應(yīng)用。結(jié)果證明,該方法的特異性好,檢測(cè)限低,純基因水平檢測(cè)限在3pg左右,絕對(duì)靈敏度檢測(cè)達(dá)到103CFU/mL,且重復(fù)性較好;在純基因水平與培養(yǎng)物水平的抗干擾能力都很強(qiáng);模擬樣品檢測(cè)中其檢測(cè)限未改變,重復(fù)性較好,證明適合在市場(chǎng)檢測(cè)中使用;實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽信息一致。并得出嗜酸乳桿菌相應(yīng)的添加量,只是嗜酸乳桿菌的含量有所不同。這一研究證明該方法可應(yīng)用在乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的快速檢測(cè)。

編輯:songjiajie2010

 
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