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新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析手段-氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)進展

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2012-03-13  來源:沃特世科技(上海)有限公司實驗中心
核心提示: 新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析手段-氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)進展

氫氘交換質(zhì)譜法是一種研究蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的質(zhì)譜技術(shù)。它在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點發(fā)現(xiàn)、蛋白表位及活性位點鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用。隨著氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展,它正在成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)家及生物藥物研發(fā)的重要手段。
 
氫氘交換質(zhì)譜(HDX MS,hydrogen deuterium exchange mass spectrometry)是一種研究蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的質(zhì)譜技術(shù)。其原理是將蛋白浸入重水溶液中,蛋白的氫原子將于重水的氘原子發(fā)生交換,而且蛋白質(zhì)表面與重水密切接觸的氫比位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的或參與氫鍵形成的氫的交換速率快,進而通過質(zhì)譜檢測確定蛋白質(zhì)不同序列片段的氫氘交換速率,從而得出蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)信息[1]。這個過程就像將握著的拳頭浸入水中,然后提出水面并張開手掌。這時,濕潤的手背表明它在“拳頭”的結(jié)構(gòu)中處于外表面,而較為干燥的手心表明它是“拳頭”的內(nèi)部。除樣品制備外,氫氘交換質(zhì)譜法的主要過程包括:交換反應(yīng)、終止反應(yīng)、將蛋白快速酶切為多肽、液相分離、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)解析。其中交換步驟需要在多個反應(yīng)時長下進行,如0s、10s、1min、10min、60min等,以繪制交換率曲線,得到準確全面的信息。氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化研究[1]、蛋白質(zhì)相互作用位點發(fā)現(xiàn)[2]、蛋白表位及活性位點鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用[3]。
 
與經(jīng)典的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法相比,如X射線晶體衍射(X-Ray Crystallography)和核磁共振(NMR. Nuclear Magnetic Resonance)等方法,氫氘交換質(zhì)譜不能夠提供精確的蛋白空間結(jié)構(gòu),它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的表面位置(包括動態(tài)變化中的)、可能的活性位點和蛋白-蛋白相互作用位點等。但是氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)有著其他經(jīng)典方法不具備的優(yōu)點:首先,可以進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的研究是氫氘交換質(zhì)譜的一個突出優(yōu)點,包括變化中的活性位點及表位;其次,氫氘交換質(zhì)譜在蛋白復(fù)合體構(gòu)象的研究中也具有獨到的優(yōu)勢;此外,氫氘交換質(zhì)譜還具有對樣品需求量小、純度要求相對較低、研究對象為溶液環(huán)境下的蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象而非晶體中構(gòu)象等優(yōu)勢[1,4,5]。自1991年第一篇研究論文發(fā)表起,氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)展,已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)及質(zhì)譜技術(shù)中一個非常重要的應(yīng)用領(lǐng)域[6]。但是氫氘交換質(zhì)譜實驗的復(fù)雜的實現(xiàn)過程在一定程度上影響了其應(yīng)用的廣泛度。主要的難點有:1、如何避免交換后氘代肽段的回交現(xiàn)象;2、實驗控制的高精確性和重現(xiàn)性要求;3、交換后造成的疊加的質(zhì)譜峰如何準確分辨;4、簡易高效的分析軟件需求;5、以氨基酸為單位的交換位點辨析。沃特世公司自2005年起,針對以上難點不斷進行攻關(guān),推出了目前唯一商業(yè)化的全自動氫氘交換質(zhì)譜系統(tǒng)解決方案--nanoACQUITY UPLC? HD-Exchange System(圖1)。在全世界范圍內(nèi),這套系統(tǒng)已經(jīng)幫助科學(xué)家在包括Cell、Nature等頂級研究期刊中發(fā)表研究論文[7,8]。除科研需求外,沃特世氫氘交換質(zhì)譜系統(tǒng)也受到眾多國際領(lǐng)先制藥公司的認可,并用于新藥開發(fā)中蛋白藥物活性位點及表位的研究工作中。


 
氫氘交換實驗中的回交現(xiàn)象將嚴重影響實驗數(shù)據(jù)的可信度,甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)果的產(chǎn)生。要避免回交需要做到兩點:盡量縮短液質(zhì)分析時間和保證液質(zhì)分析中的溫度和pH為最低回交反應(yīng)系數(shù)所要求的環(huán)境。沃特世UPLC?系統(tǒng)采用亞二納米色譜顆粒填料,較HPLC使用的大顆粒填料,UPLC具有無與倫比的分離度。因此UPLC可以做到在不損失色譜分離效果的要求下,極大縮短液相分析時間的要求[9]。對于對溫度和pH控制問題,在多年的工程學(xué)改進中,nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已經(jīng)實現(xiàn)了對酶切、液相分離等步驟的全程控制[10]。
 
對氫氘交換質(zhì)譜實驗精確性和重現(xiàn)性的要求是其應(yīng)用的第二個主要難點。在實驗中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多個時間點的數(shù)據(jù)。如果進行人工手動實驗,很難做到對10S-10min等幾個時間點的精確操作。再考慮到重復(fù)實驗的需求,人工手動操作會對最終數(shù)據(jù)可信度產(chǎn)生影響。而且實驗過程重復(fù)繁瑣,將給實驗人員帶來非常大的工作壓力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通過智能機械臂,精確完成交換、終止交換、進樣、酶切等一系列實驗過程,而且始終保證各個步驟所需不同的溫度環(huán)境。這些自動化過程不但保證了實驗數(shù)據(jù)的可靠性,提高了實驗效率,也將科學(xué)家從繁瑣的重復(fù)實驗中解放出來。
 
氫氘交換實驗的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中,隨著交換時間的延長,發(fā)生了交換反應(yīng)的多肽,由于質(zhì)量變大,其質(zhì)譜信號將逐漸向高質(zhì)荷比方向移動。因此,這些質(zhì)譜峰可能與哪些未發(fā)生交換反應(yīng)的多肽質(zhì)譜峰逐漸疊加、相互覆蓋。相互疊加的質(zhì)譜信號,不但影響對峰歸屬的判斷,更會增加交換率數(shù)據(jù)的誤差。因為交換率判斷需要通過對發(fā)生交換的多肽進行定量,毫無疑問因疊加的而混亂的質(zhì)譜數(shù)據(jù)將極大的影響對質(zhì)譜峰的準確定量。這點對于單純通過質(zhì)荷比進行分析的質(zhì)譜儀來說完全無能為力。但是,這個看似不可能完成的任務(wù)卻被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。這是因為,不同于其它常見質(zhì)譜,沃特世的SYNAPT?質(zhì)譜平臺還具備根據(jù)離子大小及形態(tài)進行分離的功能(行波離子淌度分離)。在數(shù)據(jù)處理時,除多肽離子的質(zhì)荷比信息外,還可以通過離子遷移時間(離子淌度維度參數(shù))將不同離子區(qū)分。因此這種SYNPAT獨有的被命名為HDMSE的質(zhì)譜分析技術(shù)可以將因質(zhì)荷比相同而重疊的多肽分離開,輕而易舉地解決了質(zhì)譜信號疊加的問題,得到準確的交換率數(shù)據(jù)[11,12](圖2)。SYNPAT質(zhì)譜平臺一經(jīng)推出就奪得了2007年P(guān)ITTCON金獎,目前已經(jīng)推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型號,并具備ESI、MALDI等多種離子源。除氫氘交換技術(shù)外,SYNAPT質(zhì)譜系統(tǒng)在蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)研究中也是獨具特色,已有多篇高質(zhì)量應(yīng)用文獻發(fā)表[13,14,15]。
實現(xiàn)氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的第四個關(guān)鍵點,是如何高效分析實驗產(chǎn)生的多時間點及多次重復(fù)帶來的大量數(shù)據(jù)。人工完成如此巨大的信息處理工作,將消耗科學(xué)家大量的時間。沃特世氫氘交換質(zhì)譜解決方案所提供的DynamX軟件可以為科學(xué)家提供簡便直觀的分析結(jié)果,并包含多種呈現(xiàn)方式。
 
在某些特殊研究中,要求對蛋白氫氘交換位點做到精確到氨基酸的測量,這是氫氘交換質(zhì)譜研究的又一個難點。在常規(guī)的研究中采用CID(碰撞誘導(dǎo)解離)碎裂模式,可能導(dǎo)致氘原子在多肽內(nèi)重排,而致使不能對發(fā)生交換的具體氨基酸進行精確定位。SYNPAT質(zhì)譜提供的ETD(電子轉(zhuǎn)移解離)碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混亂,并具有良好的碎裂信號[16]。
沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System為氫氘交換質(zhì)譜實驗提供了前所未有的簡易的解決方案,強有力地推動了氫氘交換技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點發(fā)現(xiàn)、蛋白表位以及活性位點鑒定方面的應(yīng)用,正在成為眾多結(jié)構(gòu)生物學(xué)科學(xué)家和生物制藥企業(yè)必不可少的工作平臺。
 
編輯:songjiajie2010

 
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