蛋白質(zhì)糖基化是生命系統(tǒng)非常重要的翻譯后修飾之一，在免疫識(shí)別，蛋白分泌，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程中發(fā)揮了重要作用。與蛋白相連的多聚糖是這些功能的重要載體，特別是對(duì)于單克隆抗體藥物，多聚糖部分對(duì)藥物的生物活性有著重要的影響。因此，發(fā)展分離效率高，檢測(cè)靈敏度好的糖基化分析方法對(duì)單克隆抗體藥物分析具有十分重要的意義。

 

針對(duì)糖基化分析中的種種困難，沃特世公司開發(fā)了親水作用色譜法，以及熒光-質(zhì)譜結(jié)合檢測(cè)的分析方法。ACQUITY UPLC系統(tǒng)配合熒光檢測(cè)器?(FLR)以及多聚糖分析專用(GST )色譜柱，比HPLC方法有更高的分離度。多聚糖分析專用色譜柱裝填了1.7μm的酰胺吸附劑，可在HILIC模式下有效分離熒光標(biāo)記的多聚糖。UPLC配合熒光檢測(cè)器®分析多聚糖可以獲得很高的分離度和定量準(zhǔn)確性，特別是對(duì)于位置異構(gòu)體以及有共流出的小峰分析；而質(zhì)譜檢測(cè)為糖鏈鑒定提供了更多的結(jié)構(gòu)信息。通過與標(biāo)準(zhǔn)糖鏈保留時(shí)間的比較，該流程能實(shí)現(xiàn)高通量的多聚糖定性定量，滿足藥物分析的多種需求。
 

一、色譜條件與標(biāo)記后的多聚糖樣品的分離

可通過HILIC方法，有效分離2-AB標(biāo)記的多聚糖混合物。對(duì)于方法優(yōu)化，使用更緩的窄梯度，可有效提高保留時(shí)間上相臨近的多聚糖峰之間的分離度；對(duì)于其它的參數(shù)，如流速、緩沖液濃度、流動(dòng)相pH及柱溫等，一般也需要進(jìn)行優(yōu)化。圖1示例使用優(yōu)化后的HILIC色譜條件后，復(fù)雜的2-AB標(biāo)記的IgG多聚糖混合物得到了很好的分離，包括E1/ E2與F1/ F2。實(shí)驗(yàn)所用梯度洗脫時(shí)間為45分鐘，包括色譜柱清洗和再平衡步驟。一般來說，一個(gè)樣品的總分析時(shí)間在1小時(shí)內(nèi)。因此，與使用3.0-μm填料的HPLC方法相比，使用1.7-μm填料的UPLC色譜方法，不但分離效果更好，而且運(yùn)行時(shí)間更短。實(shí)驗(yàn)中使用2.1 x150 mm色譜柱。圖1(B)中甘露糖5(峰C)與甘露糖6(峰H)可與鄰近多聚糖峰成功分離，解決了共流出的問題。

二、2-AB標(biāo)記的多聚糖定量及結(jié)構(gòu)鑒定

由于多聚糖在HILIC 模式下能實(shí)現(xiàn)基線分離，各種異構(gòu)體，例如末端唾液酸的位置異構(gòu)，都能得到很好的分離。因此，在熒光檢測(cè)器下的峰面積積分能對(duì)各種糖鏈進(jìn)行定量分析。而從MS譜圖來看，多聚糖樣品中高甘露糖糖型所占比例較高，而復(fù)合型及雜合型糖鏈也都能夠得到鑒定。各種帶有神經(jīng)氨酸的糖鏈也都能得到鑒定，表明該方法能夠適合各種多聚糖復(fù)合物的分析。除了分子量，我們還能通過MS/MS譜圖進(jìn)一步確認(rèn)多聚糖的結(jié)構(gòu)。

 

2-AB標(biāo)記的IgG多聚糖混合物的分析結(jié)果充分說明沃特世提供了成熟的聚糖分析方案，且相應(yīng)色譜柱的質(zhì)量控制采用了2-AB標(biāo)記的IgG多聚糖混合物進(jìn)行。ACQUITYUPLC系統(tǒng)顯著縮短了分析時(shí)間，將常規(guī)HPLC上需要2個(gè)小時(shí)甚至3個(gè)小時(shí)的分離梯度縮短到1小時(shí)。 此外沃特世提供UPLC-FLR-MS的整體解決方案可以十分有效的對(duì)多聚糖進(jìn)行分析，除提供分子量信息外，還可以進(jìn)行糖結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，大大降低了生物藥物研發(fā)工作中糖基化分析的難度。
 

一、2-AB 標(biāo)記糖鏈

使用GlycoPro  le試劑盒，Prozyme公司

使用試劑盒進(jìn)行2-AB 標(biāo)記糖鏈時(shí)，除以下步驟，按照該公司的說明操作即可。

1.使用50μl的標(biāo)記反應(yīng)液

2. 65度反應(yīng)4-5小時(shí)

3.將樣品按步驟4處理除掉過量的標(biāo)記試劑

 

使用Sigma公司試劑

1. 配制3 0% 的醋酸D M S O 溶液（ 3 0 μ l 冰醋酸，700ulDMSO）

2.按照20：1（v/w）的比例配制2-AB 溶液 （如需要20mg 2-AB，則用400μl 30% 的醋酸DMSO溶液配制）

3.以16.7：1（v/w）的比例將2-AB溶液與氰基硼氫化鈉混合配制標(biāo)記反應(yīng)液

4.將所得糖鏈用50μl標(biāo)記反應(yīng)液溶解，65度震蕩反映4-5小時(shí)

5 .將反應(yīng)液按步驟4處理除去過量的標(biāo)記試劑
 

二、使用MassPrep親水作用樣品處理板除去過量的標(biāo)記試劑

所需溶液: MiniQ 純水，90% 乙腈 ACN，10 mM 醋酸銨Tris，20% ACN

1.樣品處理板活化，向樣品處理板加入200μl MiniQ純水，再加入 200μl 90% ACN，重復(fù) 90% ACN

2.吸取 50μl 標(biāo)記溶液，加入 450μl ACN（ 如有沉淀，請(qǐng)勿離心，以免降低糖鏈回收率），由于板上每孔體積為200μl，可以將樣品分為四份加入

3.將樣品加入處理板，設(shè)定真空度為低（壓力 250-500 mmHg），以保證樣品與HILIC基質(zhì)有充分時(shí)間相互作用；如果溶液在板上沒有移動(dòng)，可適當(dāng)增加真空度

4.用 90% ACN清洗處理板兩次

5.換用樣品收集板，用200μl 10 mM 醋酸銨Tris， 20%ACN洗脫，洗脫液轉(zhuǎn)移至1ml 離心管

6.冷凍干燥標(biāo)記后糖鏈溶液凍干后的樣品復(fù)溶于20μl50% ACN中，超聲5 min 后轉(zhuǎn)入U(xiǎn)PLC采樣瓶，進(jìn)樣5μl。

 

參考文獻(xiàn)

(1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column

(2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine

(3) Joomi Ahn，Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC親水相互作用色譜(HILIC)-熒光檢測(cè)法分析2-AB標(biāo)記的多聚糖