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非標(biāo)記抗體酶法--PAP法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-09-22  來源:實驗室資訊網(wǎng)
核心提示:PAP復(fù)合物是離體制備的HRP抗HRP復(fù)合物,它的制備方法較多,現(xiàn)簡介其中之一。(1)制備抗HRP血清:健康雄性家兔(2.Okg以上),可
 
PAP復(fù)合物是離體制備的HRP抗HRP復(fù)合物,它的制備方法較多,現(xiàn)簡介其中之一。
(1)制備抗HRP血清:健康雄性家兔(2.Okg以上),可先于足趾皮下注射滅活的卡介苗(共lOmg),2周后重復(fù)1次,刺激機體免疫系統(tǒng)功能,1周后于背部脊柱兩旁皮內(nèi)多點注射1.Oral乳劑[福氏完全佐劑,含HRP3。3mg(RZ=3.0)L間隔2周第2次注射,背部注入含3.3mg HRP的不完全福氏佐劑1.0ml;再間隔2周,第3次注射,2mgHRP(溶于2ml生理鹽水中),分別于前后小腿皮下和背部肌肉內(nèi)多點注射,1周后采靜脈血,檢查效價。再隔1周第4次加強注射(條件同第3次),1周后檢查抗體效價,瓊脂糖擴散法(HRP 0.1mg/m1)為1:128以上時,頸動脈取血,制備血清低溫保存?zhèn)溆谩?/div>
(2)制備PAP復(fù)合物:離體條件下,使兔抗HRP抗體與HRP形成可溶性復(fù)合物。在制備抗HRP血清時,HRP的純度要高(RZ≥3),而制備PAP復(fù)合物時,HRP的質(zhì)量要求不高,甚至可用酶的粗制品。主要步驟如下:
①取HRP血清,力D 7.6ml含7.6mgHRP(1。0mg/m1)的水溶液。
②混勻,室溫1h后,4℃環(huán)境下離心16 000r 15min。
③0.9%NaCI(冷鹽水)溶解沉淀,4℃環(huán)境下離心16 000r15min,重復(fù)4次。
④加15.3ml HRP水溶液,在室溫下持續(xù)攪拌。
⑤用lmol/L及0.1mol/l HCl調(diào)pH至2.3,當(dāng)沉淀物全部溶解變清,立即用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.2[1N怨(mol/L×離子價數(shù))]。
⑥慢慢加入等體積的飽和硫酸銨,0℃環(huán)境下放置45min。
⑦離心35 000r 0℃15min,沉淀用50%硫酸銨漂洗兩次。
⑧用10.5ml水溶解沉淀,對透析液[48.6g NaCl,1.5mol/I。NaOOCCH,30ml,3mol/L(NH+)2804 30ml,水5.94L]透析,4℃環(huán)境下離心,收集上清液,加透析液使體積至10.5ml,分裝低溫保存。
(3)PAP復(fù)合物的質(zhì)量鑒定:制備的PAP復(fù)合物應(yīng)檢測酶和抗體的含量,以鑒定PAP復(fù)合物的質(zhì)量。常用分光光度計檢測PAP的復(fù)合物在280nm(1gG的最大吸收波長)和400nm(HRP的最大吸收波長)的光密度值(OD值),按下式計算IgG和HRP的含量。
一般HRP/抗HRP的克分子比達1.9時,可分裝冷藏于一85’C冰箱。由于稀釋后的PAP復(fù)合物不穩(wěn)定,4℃環(huán)境下只能保存2~3周。因此,最好臨用前配制。
(4)PAP復(fù)合物的特征:PAP復(fù)合物的形成不同于其他抗原抗體反應(yīng),在抗原稍過量時,所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復(fù)合物,僅殘留少許游離的HRP,而大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)需要抗原絕對過量才能形成可溶性復(fù)合物。PAP復(fù)合物的形狀相當(dāng)穩(wěn)定,不受抗原量的影響,無論最初加入的抗原抗體過量與否,最終形成的PAP復(fù)合物其HRP與抗HRP之比絕大部分為3;2。應(yīng)用離心沉降、液相擴散等方法分析表明:PAP復(fù)合物沉降系數(shù)為11.5s,分子量為400—430kD,由此可推算出酶與抗體之比為3:2,即每個PAP生命物由3個HRP分子和2個抗HRP抗體組成,呈五角形結(jié)構(gòu),3個角為HRP,另兩個角為抗HRP抗體。采用H2O2—DAB染色,電子顯微鏡下已經(jīng)觀察到PAP復(fù)合物五角形環(huán)狀結(jié)構(gòu),直徑平均21nm。這種結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定。據(jù)報道PAP復(fù)合物的抗HRP抗體與HRP結(jié)合常數(shù)為108,在此可溶性復(fù)合物中,即使存在少量游離HRP,亦不影響其穩(wěn)定性。
(5)PAP染色原理:與酶橋法相似,都是借助橋抗體將酶連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第1抗體上,所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3和步驟4合并為一步,用PAP復(fù)合物代替,即第3步用PAP復(fù)合物孵育切片,故稱PAP法。PAP復(fù)合物中的抗HRP抗體和第1抗體為相同種屬動物的IgG,所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復(fù)合物連結(jié)在第1抗體上。
(6)PAP染色步驟:主要步驟與酶橋法相似。
PAP法主要染色步驟
①切片準(zhǔn)備及第1抗體孵育前處理同間接法;切片與特異性第1抗體孵育同酶橋法。
②用過量的橋抗體孵育,作用同酶橋法。
③用離體制得的PAP復(fù)合物(1:30~300稀釋)孵育1~1.5h(室溫),使其被橋抗體連結(jié)在第1抗體上。亦可用ALP抗ALP復(fù)合物代替。
④顯色觀察同間接法。
 
編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: 非標(biāo)記抗體酶法 PAP法
 

 
 
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