一、免疫胶体金技术的基本知识

1、胶体金的概念

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

2、免疫金标记技术

胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。胶体金对蛋白质有很强的吸附功能，蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面，无共价键形成，标记后大分子物质活性不发生改变。

3、胶体金的示踪原理

金颗粒具有高电子密度的特性。金标蛋白在相应的配体处大量聚集时，在显微镜下可见黑褐色颗粒或肉眼可见红色或粉红色斑点。

免疫金银染色：利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，通过银颗粒的沉积，在光镜下可见抗原抗体反应的阳性部位呈现银的黑褐色。

二、胶体金的制备

1、胶体金制备的注意事项

（1）玻璃容器的清洁：玻璃容器应绝对清洁，用前酸洗、硅化。

（2）试剂、水质：实验用水一般用双蒸水。缓冲液有足够大的缓冲容量，浓度不应过高以免金溶胶自凝。

2、常用方法

一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、白磷。

（1）柠檬酸三钠还原法：

取0.01％氯金酸水溶液100 ml加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液0.7 ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535 nm，Ａ1 cm/535 nm=1.12。

100 ml氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响：

１％柠檬酸三钠（ml ）0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00

金溶胶颜色                   蓝灰 紫灰  紫红 红   橙红  橙

吸收峰(nm)                    220   240    535   525   522   518

径粒(nm)                        147   97.5   71.5   41   24.5   15

（2）柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：改变鞣酸的加入量，制得不同大小的胶体颗粒。

（3）白磷还原法：制备的胶体金直径约6 nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。

三、免疫胶体金的制备

1、制备胶体金标记蛋白质应注意的问题

（1）蛋白质的预处理。蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成分。用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。

（2）低盐浓度的缓冲液。过量盐可使金颗粒发生凝集。

（3）PH接近于蛋白质等电点或略偏碱性。蛋白质所处溶解状态最适合偶联，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。

（4）蛋白质最适用量的选择：能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

（5）胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。

2、常见方法

（1）用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。

（2）加入最佳标记量的蛋白质溶液，搅拌2～3分钟。

（3）加入5 ml 1％PEG20000 溶液。

（4）于10000～100000 g离心，小心吸去上清液。

（5）将沉淀悬浮于一定的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1 cm/540 nm=1.5左右为宜，置4 ℃保存。

 四、免疫胶体金的应用

1、胶体金在光镜水平、电镜水平的应用

直径为3～15 nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒进行双重或多重标记。

胶体金用于光镜水平、电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织切片中抗原的检测。

2、胶体金在流式细胞仪中的应用

应用胶体金标记的抗体，分析细胞表面抗原。胶体金可以明显地改变红激光散射角，区分不同的标记，能同时进行几种标记。

3、凝集试验

单分散的免疫金溶胶清澈透明。与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒增大、沉降，光散射随之发生变化，溶液的颜色发生变化。

4、免疫印迹技术

用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，与特异性的抗体保温后，再与胶体金标记物温育，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。金免疫印迹技术有相当高的灵敏度。采用免疫金银染色法，灵敏度可低至0.1 ng。

5、胶体金在肉眼水平的应用--胶体金免疫结合试验

根据检测装置的不同可分为金免疫层析试验和金免疫渗滤试验。

1、金免疫层析试验

（1）免疫层析条的组成，有4个组分：⑴吸水纸（加样区）。⑵玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。⑶硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。⑷吸水纸。以上各组分首尾互相衔接。

（2）免疫层析条制作中须注意的几个问题

微孔滤膜：硝酸纤维素膜有2个特性：较高的蛋白吸附容量和良好的亲水性，应用最多。硝酸纤维素膜的活化：先使硝酸纤维素膜上形成氨基手臂，然后再加入戊二醛在手臂上形成自由醛基，多肽与活化膜的活性基团共价联接。

受体：①与膜材料的结合稳定。②有较高的生物活性，因而有足够的配体捕获容量。③有较高的纯度，以保证检测的特异性。④可流动性。标记或非标记受体以干态吸附于流动带，在流动带加入高效助溶剂，从而使受体具有快速溶解的特性。

（3）反应模式有夹心法、间接法、竞争法

例1 金免疫层析法检测吗啡（竞争法）：

吗啡是鸦片类镇痛药，抑制中枢神经系统。是可待因和海洛因的主要代谢物质，吗啡不经代谢即可排泄。

测定原理：吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体，最小检出量300 ng/ml。

结果判定：

阳性（+）：吗啡300 ng/ml以上，质控区出现一条紫红色条带，测试区内不出现紫红色条带。吗啡浓度高于300 ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带。阴性（-）：吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带，一条在测试区内，另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合，测试区内会出现一条紫红色条带。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

质控区 测试区 流动带

二抗 吗啡偶联物 金标单抗

例2 金层析免疫法测定甲胎蛋白（夹心法）：

甲胎蛋白（AFP）是原发性肝癌的肿瘤标示物，对肝癌的早期诊断、早期治疗具有重要临床意义。AFP单抗A、B，羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上，金标AFP单抗C固定于玻璃纤维素膜上。阴性1条带，阳性2条带， 3条带为强阳性，不出现有色条带为试剂失效。

质控带 阳性 阳性 流动带

羊抗鼠二抗 单抗A 单抗B 金标单抗C

例3 金免疫层析法检测梅毒抗体（间接法）：

胶体金标记的抗人IgG，样品中的梅毒抗体与胶体金标记的抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，在包被有基因重组的梅毒螺旋体抗原结合，出现红色反应线。

质控带 阳性 流动带

抗原 金标抗人IgG

2、金免疫渗滤分析

（1）试剂盒：渗滤装置为一充满吸水垫料的塑料小盒，在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜，膜上预包被抗原或抗体斑点。

（2）反应模式：间接法、夹心法、捕获法、竞争法。

间接法：抗原固定于膜上→标本（抗体），洗涤→金标二抗。

夹心法：抗体A固定于膜上→标本（抗原）→金标单抗B。

捕获法：在固相载体上包被二抗→样品（待测抗体）→抗原→金标单抗。

竞争法：在载体上包被抗体→加入待测抗原→加入标记抗原

3、金免疫层析分析和金免疫渗滤分析的比较

（1）相同点：检测原理相同。以微孔滤膜为载体，滤膜的毛细管作用促进抗原抗体结合反应，通过胶体金结合物达到检测目的。

（2）不同点：

硝酸纤维素膜的种类、形式及组成方式。金免疫层析分析为狭长形膜，由4部分组成，依次是吸水纸、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸。金免疫渗滤分析为圆形硝酸纤维素膜及底层的吸水垫料。

标记配体的形式。金免疫层析分析为固相形式，金免疫渗滤分析为液相形式。

液体的移动方向。金免疫层析分析是通过层析作用的横向流动，金免疫渗滤分析是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行。

操作步骤。金免疫层析分析大多只有加样一个步骤；金免疫渗滤分析有加样、洗涤、加标记配体等。

4、金免疫层析分析和金免疫渗滤分析特点

（1）单份测定，试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul。

（2）不需任何检测仪器，适于现场应用。

（3）没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与。

（4）实验结果可以长期保存。

（5）检测速度快，几分钟即可用肉眼观察结果。

5、胶体金免疫结合试验在临床检验中的应用

主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质、正常人含量极低而在特殊情况下异常升高的物质。

（1）激素。早早孕诊断试剂人绒毛膜促性腺激素，检测尿液。

（2）传染病病原的抗原和抗体。肝炎病毒、艾滋病病毒抗体等。

（3）性病病原：梅毒螺旋体抗体、淋球菌等。

（4）细菌：结核杆菌抗体、胃幽门螺杆菌抗体等。

（5）寄生虫：弓形虫抗体、血吸虫抗体等。

（6）肿瘤标记物：前列腺癌特异抗原（消化道恶性肿瘤尤其是结肠癌）、甲胎蛋白（肝癌）

（7）心血管病检测标志物：血清心肌肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶，诊断急性心肌梗塞。

（8）其他蛋白质：甲状腺微粒体抗体（桥本甲状腺炎）

（9）其他：血糖、尿糖及尿液中吗啡和海洛因等。

6、金免疫结合试验的发展前景

（1）进一步提高检测灵敏度。采用信号放大系统如生物素亲和素系统或免疫金银染色法，并结合一些相应的简单检测仪器。

（2）实现检测多元化。在同一膜上作多种项测定，检测某些具有联检意义的物质。

（3）实现定量或半定量检测。

GIFA可用反射光密度计对斑点颜色的强度进行测定，可得到半定量的结果；控制受体捕获量：固定多种不同量的受体，在膜上包被多条反应线，观察各自显色情况，将待测物含量确定于某一浓度区间。

（4）通用试剂的应用。

胶体金标记葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG标记物；链亲和素可作为通用固定受体，与各种生物素化抗体结合用于检测相应的抗原性物质。