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DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-07-29  來源:實(shí)驗(yàn)室資訊網(wǎng)
核心提示:(一)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)?雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(double helix model)  1953年,Watson和Crick提出了著名的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,揭
 (一)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)?雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(double helix model)

  1953年,Watson和Crick提出了著名的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,揭示了遺傳信息是如何儲(chǔ)存在DNA分子中,以及遺傳性狀何以在世代間得以保持。這是生物學(xué)發(fā)展的重大里程碑。

  在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型建立之前,早在1868年,Miescher已經(jīng)從膿細(xì)胞提取到核酸與蛋白質(zhì)的復(fù)合物,當(dāng)時(shí)稱為核素(nuclein)。但核酸在生命活動(dòng)中的重要地位,卻遲至本世紀(jì)50年代才被認(rèn)識(shí)。

  本世紀(jì)20年代,Levene研究了核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)并提出四核苷酸假說;40年代末,Avery,Hershey和Chase的實(shí)驗(yàn)嚴(yán)密地證實(shí)了DNA就是遺傳物質(zhì);50年代初,Chargaff應(yīng)用紫外分光光度法結(jié)合紙層析等簡(jiǎn)單技術(shù),對(duì)多種生物DNA作堿基定量分析,發(fā)現(xiàn)DNA堿基組成有如下規(guī)律(表15-3)。?

表15-3 不同生物來源的DNA四種堿基比例關(guān)系
 


 

 

DNA來源  腺嘌呤(A)  胸腺嘧啶(T)  鳥嘌呤(G)  胞嘧啶(C)  (A+T)/(G+C) 
大腸桿菌  25.4  24.8  24.1  25.7  1.01 
小麥  26.8  28.0  23.2  22.7  1.21 
鼠  29.7  25.6  21.9  22.8  1.21 
豬:肝  29.4  29.7  20.5  20.5  1.43 
胸腺  30.0  28.9  20.4  20.7 
脾  29.6  29.2  20.4  20.8 
酵母  31.3  32.9  18.7  17.5  1.079 

 

 

 。1)同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同;

  (2)一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變;

 。3)幾乎所有的DNA,無論種屬來源如何,其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同(A]=[T),鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同(G]=[C),總的嘌呤摩爾含量與總的嘧啶摩爾含量相同([A+G]=[C]+[T)。

 。4)不同生物來源的DNA堿基組成不同,表現(xiàn)在A+T/G+C比值的不同;

  這些結(jié)果后來為DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提供了一個(gè)有力的佐證。

  Watson和Crick以立體化學(xué)原理為準(zhǔn)則,對(duì)Wilkins和Franklin的DNa X?射線衍射分析結(jié)果加以研究,提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模式,其主要內(nèi)容如下:

  A.正面觀:長方框內(nèi)有詳細(xì)說明,S代表脫氧核糖。?

  B.俯視:涂黑的是堿基,此處全部堿基都是嘧啶,只看到糖的側(cè)面略呈三角形,最外圍是磷酸及其酯鍵。

 。1)在DNA分子中,兩股DNA鏈圍繞一假想的共同軸心形成一右手螺旋結(jié)構(gòu),雙螺旋的螺距為3.4nm,直徑為2.0nm.。

 。2)鏈的骨架(backbone)由交替出現(xiàn)的、親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成,位于雙螺旋的外側(cè)。

 。3)堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè),兩股鏈中的嘌呤和嘧啶堿基以其疏水的、近于平面的環(huán)形結(jié)構(gòu)彼此密切相近,平面與雙螺旋的長軸相垂直。一股鏈中的嘌呤堿基與另一股鏈中位于同一平面的嘧啶堿基之間以氫鏈相連,稱為堿基互補(bǔ)配對(duì)或堿基配對(duì)(base pairing),堿基對(duì)層間的距離為0.34nm.堿基互補(bǔ)配對(duì)總是出現(xiàn)于腺嘌呤與胸腺嘧啶之間(A=T),形成兩個(gè)氫鍵;或者出現(xiàn)于鳥嘌呤與胞嘧啶之間(G=C),形成三個(gè)氫鍵。

  (4)DNA雙螺旋中的兩股鏈走向是反平行的,一股鏈?zhǔn)?′→3′走向,另一股鏈?zhǔn)?′→5′走向。兩股鏈之間在空間上形成一條大溝(major groove)和一條小溝(minor groove),這是蛋白質(zhì)識(shí)別DNA的堿基序列,與其發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)。

  DNA雙螺旋的穩(wěn)定由互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵和堿基對(duì)層間的堆積力(base?stacking force)維系。DNA雙螺旋中兩股鏈中堿基互補(bǔ)的特點(diǎn),邏輯地預(yù)示了DNA復(fù)制過程是先將DNA分子中的兩股鏈分離開,然后以每一股鏈為模板(親本),通過堿基互補(bǔ)原則合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈(復(fù)本),形成兩個(gè)完全相同的DNA分子。因?yàn)閺?fù)制得到的每對(duì)鏈中只有一條是親鏈,即保留了一半親鏈,將這種復(fù)制方式稱為DNA的半保留復(fù)制(semi?conservative replication)。后來證明,半保留復(fù)制是生物體遺傳信息傳遞的最基本方式。

  DNA雙螺旋是核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要形式。雙螺旋結(jié)構(gòu)理論支配了近代核酸結(jié)構(gòu)功能的研究和發(fā)展,是生命科學(xué)發(fā)展史上的杰出貢獻(xiàn)。

 。ǘ〥NA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性

  Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)屬于B型雙螺旋,它是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92%相對(duì)濕度下進(jìn)行X-射線衍射圖譜為依據(jù)進(jìn)行推測(cè)的,這是DNA分子在水性環(huán)境和生理?xiàng)l件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。然而以后的研究表明DNA的結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)的。在以鉀或絕作反離子,相對(duì)濕度為75%時(shí),DNA分子的X-射線衍射圖給出的是A構(gòu)象,A-DNA每螺旋含11個(gè)堿基對(duì),而且變成A-DNA后,大溝變窄、變深,小溝變寬、變淺。由于大溝、小溝是DNA行使功能時(shí)蛋白質(zhì)的識(shí)別位點(diǎn),所以由B-DNA變?yōu)锳-DNA后,蛋白質(zhì)對(duì)DNA分子的識(shí)別也發(fā)生了相應(yīng)變化。

  一般說來,A-T豐富的DNA片段常呈B-DNA.采用乙醇沉淀法純化DNA時(shí),整個(gè)過程中,大部分DNA由B-DNA經(jīng)過C-DNA,最終變構(gòu)為A-DNA.若DNA雙鏈中一條鏈被相應(yīng)的RNA鏈所替換,會(huì)變構(gòu)成A-DNA.當(dāng)DNA處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)時(shí),DNA模板鏈與由它轉(zhuǎn)錄所得的RNA鏈間形成的雙鏈就是A-DNA.由此可見A-DNA構(gòu)象對(duì)基因表達(dá)有重要意義。此外,B-DNA雙鏈都被RNA鏈所取代而得到由兩條RNA鏈組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)也是A-DNA.除A-DNA、B-DNA螺旋外,還存在B′-DNA、C-DNA、D-DNA等,其結(jié)構(gòu)參數(shù)見表15-4.?

表15-4 不同右手雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)
 


 

 

雙螺旋  堿基傾  堿基夾  堿基間距  螺距  每輪堿  小溝寬/nm×  大溝寬nm× 
   角/(°)  角(°)  /nm  /nm  基數(shù)  小溝寬nm  大溝寬nm 
B-DNA  0  36.0  0.337  3.4  10  0.57×0.75  1.17×0.85 
C-DNA  6  38.0  0.331  3.1  9.3  0.48×0.79  1.05×0.75 
D-DNA     45.0  0.303        0.13×0.67  0.89×0.58 
A-DAN  20  32.7  0.256  2.8  11  1.10×0.28  0.27×1.35 

 

 

  總之,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)永遠(yuǎn)處于動(dòng)態(tài)平衡中,DNA分子構(gòu)象的變化與糖基和堿基之間空間相對(duì)位置有關(guān)。

  1979年,Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X-射線衍射圖譜時(shí)出人意料地發(fā)現(xiàn)這種六聚體的構(gòu)象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋,與右手螺旋的不同是螺距延長(4.5nm左右),直徑變窄(1.8nm),每個(gè)螺旋含12個(gè)堿基對(duì),分子長鏈中磷原子不是平滑延伸而是鋸齒形排列,有如“之”字形一樣,因此叫它Z構(gòu)象(英文字Zigzag的第一個(gè)字母)。還有,這一構(gòu)象中的重復(fù)單位是二核苷酸而不是單核苷酸;而且Z?DNA只有一個(gè)螺旋溝,它相當(dāng)于B構(gòu)象中的小溝,它狹而深,大溝則不復(fù)存在。進(jìn)一步的分析還證明,Z-DNA的形成是DNA單鏈上出現(xiàn)嘌呤與嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA.

  Z-DNA有什么生物學(xué)意義呢?應(yīng)當(dāng)指出Z-DNA的形成通常在熱力學(xué)上是不利的。因?yàn)閆-DNA中帶負(fù)電荷的磷酸根距離太近了,這會(huì)產(chǎn)生靜電排斥。但是,DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點(diǎn)。DNA解螺旋卻是DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程中必要的環(huán)節(jié),因此認(rèn)為這一結(jié)構(gòu)與基因調(diào)節(jié)有關(guān)。比如SV40增強(qiáng)子區(qū)中就有此結(jié)構(gòu),又如鼠類微小病毒DNS復(fù)制區(qū)起始點(diǎn)附近有GC交替排列序列。此外,DNA螺旋上溝的特征在其信息表達(dá)過程中起關(guān)鍵作用。調(diào)控蛋白都是通過其分子上特定的氨基酸側(cè)鏈與DNA雙螺旋溝中的堿基對(duì)一側(cè)的氫原子供體或受體相互作用,形成氫鍵從而識(shí)別DNA上的遺傳信息的。大溝所帶的遺傳信息比小溝多。溝的寬窄和深淺也直接影響到調(diào)控蛋白質(zhì)對(duì)DNA信息的識(shí)別。Z?DNA中大溝消失,小溝狹而深,使調(diào)控蛋白識(shí)別方式也發(fā)生變化。這些都暗示Z?DNA的存在不僅僅是由于DNA中出現(xiàn)嘌呤一啶嘧交替排列之結(jié)果,也一定是在漫漫的進(jìn)化長河中對(duì)DNA序列與結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整與篩選的結(jié)果,有其內(nèi)在而深刻的含意,只是人們還未充分認(rèn)識(shí)而已。

  DNA構(gòu)象的可變性,或者說DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)拓寬了人們的視野。原來,生物體中最為穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)也可以采用不同的姿態(tài)來實(shí)現(xiàn)其豐富多采的生物學(xué)功能。

  多年來,DNA結(jié)構(gòu)的研究手段主要是X射線衍射技術(shù),其結(jié)果是通過間接觀測(cè)多個(gè)DNA分子有關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)的平均值而獲得的。同時(shí),這項(xiàng)技術(shù)的樣品分析條件使被測(cè)DNA分子與天然狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。因此,在反映DNA結(jié)構(gòu)真實(shí)性方面這種方法存在著缺陷。1989年,應(yīng)用掃描隧道顯微鏡(scanning tummeling microscopy,STM)研究DNA結(jié)構(gòu)克服了上述技術(shù)的缺陷。這種先進(jìn)的顯微技術(shù),不僅可將被測(cè)物放大500萬倍,且能直接觀測(cè)接近天然條件下單個(gè)DNA分子的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。STM技術(shù)的應(yīng)用是DNA結(jié)構(gòu)研究中的重要進(jìn)展,可望在探索DNA結(jié)構(gòu)的某些未知點(diǎn)上展示巨大潛力。

  (三)DNA結(jié)構(gòu)的不均一性(heterogeneity)

  在DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)中,四種堿基A,T,C,G遠(yuǎn)非均勻分布,盡管雙螺旋的構(gòu)型大體相同,但沿著DNA鏈各處的物理結(jié)構(gòu)不完全相同,各處雙螺旋的穩(wěn)定性也就顯示出差別,充分體現(xiàn)了DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)的原理。其不均一性主要有:

  1.反向重復(fù)序列(inverted repeats)

  又稱回文序列(palindrome),它能在DNA或RNA中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這種回文結(jié)構(gòu)通常是作為一種特別信號(hào),如限制性核酸內(nèi)切酸(restriction encl閂迥onuclease)及調(diào)節(jié)蛋白的識(shí)別位點(diǎn),轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等。

  2.富含A/T的序列

  在高等生物中,A+T與G+C的含量差不多相等,然而在它們的染色體某一區(qū)域,A.T含量可能相當(dāng)高。如在很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含A.T,特別是在復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子的Pribnow框(真核生物為TATA框)的序列中,其對(duì)于復(fù)制和起始十分重要。因?yàn)锳-T對(duì)只有二條氫鍵,此處的雙鏈較G-C對(duì)處易于解開,有利于起始復(fù)合物的形成。

  3.嘌呤和嘧啶的排列順序?qū)﹄p螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。

  人們考察了十種相鄰的二核苷酸對(duì)(nearest?neighbor doublets),發(fā)現(xiàn)一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象,那就是堿基組成相同,但嘌呤和嘧啶的排列順序不同,雙螺旋的穩(wěn)定性具有顯著的差異。例如5′Gc 3′ 3′G 5′和5′GC 3′ 3′GC 5′的穩(wěn)定性相差很大,前者的穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于后。它們的氫鍵數(shù)目是相同的,它們的差別在于相鄰堿基之間的堆集力不同。即從嘌呤到嘧啶的方向的堿基堆集作用顯著地大于同樣組成的嘧啶到嘌呤方向的堿基堆集作用。(這里的方向就是常規(guī)的從5′端到3′端的方向)。這是因?yàn)榍罢叩泥堰虱h(huán)和嘧啶環(huán)重迭面積大于后者的嘧啶環(huán)和嘌呤環(huán)的重迭面積,這在B型DNA中確是如此。

  根據(jù)Gotoh 1981年的研究,十種相鄰二核苷酸對(duì)的Tm值如表15?所示,單位為℃,所用離子強(qiáng)度為19.5mmol/l Na+。

  由表15-5可以看到,5′TA 3′ 3′AT5′的Tm值最低。在真核生物中,?梢栽?19到?27的位置上看到一個(gè)叫做TATA框的結(jié)構(gòu)(又稱Hogness框),這是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。在這里RNA聚合酶和有關(guān)蛋白質(zhì)因子形成轉(zhuǎn)錄起復(fù)合物。

  又如,生命有機(jī)體選擇UAA作為最有效的終止密碼子絕不是偶然的,因?yàn)?4個(gè)三聯(lián)體密碼子中,它與反密碼子(假定有的話)形成的互補(bǔ)產(chǎn)物5′UAA3′3′AUU5′的Tm值是最低的一個(gè),即使在生理溫度下也是不穩(wěn)定的。當(dāng)初有人花了很多工夫去尋找一個(gè)不攜帶氨基酸的專供肽鏈終止用的tRNA,其實(shí)并不存在這種tRNA.肽鏈的釋放是由釋放因子RF在起作用。在三種終止密碼子中,UAG和UGA常會(huì)為突變型的tRNA無義抑制,而UAA則很少發(fā)生無義抑制也可能就是這個(gè)道理。這也就說明了為什么在肽鏈終止處常常會(huì)出現(xiàn)雙重終止密碼子。

 。ㄋ模〥NA的變性、復(fù)性與分子雜交

  DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,不僅與其生物功能有密切關(guān)系,還能解釋DNA的重要特性棗變性與復(fù)性,這對(duì)于深入了解DNA分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系又有重要意義。

  1.DNA變性(denaturation)

  指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂,堿基間的堆積力遭到破壞,但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素,如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可引起核酸分子變性。變性DNA常發(fā)生一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變:

  溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu),變性后代之以柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu),DNA粘度因此而明顯下降。

  溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個(gè)DNA分子的對(duì)稱性及分子局部的構(gòu)性改變,使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。

  增色效應(yīng)(hyperchromic effect)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè),變性時(shí)DNA雙螺旋解開,于是堿基外露,堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收,故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。

  對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行加熱變性,當(dāng)溫度升高到一定高度時(shí),DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值,隨后即使溫度繼續(xù)升高,吸光度也不再明顯變化。若以溫度對(duì)DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型(圖15?8)。可見DNA變性是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中,紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為核酸的解鏈溫度,由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似,又稱融解溫度(Tm,melting temperature)。在Tm時(shí),核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G+C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān),兩者的關(guān)系可表示為:

  Tm=69.3+0.41(%G+C)

  一定條件下(相對(duì)較短的核酸分子),Tm值大小還與核酸分子的長度有關(guān),核酸分子越長,Tm值越大;另外,溶液的離子強(qiáng)度較低時(shí),Tm值較低,融點(diǎn)范圍也較寬,反之亦然,因此DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過低的溶液中。

  2.DNA復(fù)性(renaturation)

  指變性DNA在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過程稱之為退火(annealing)。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響:

  溫度和時(shí)間。一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件,越遠(yuǎn)離此溫度,復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時(shí)溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復(fù)性幾乎是不可能的,核酸實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。這說明降溫時(shí)間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。

  DNA濃度。溶液中DNA分子越多,相互碰撞結(jié)合的機(jī)會(huì)越大。

  DNA順序的復(fù)雜性。簡(jiǎn)單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復(fù)性時(shí),互補(bǔ)堿基的配對(duì)較易實(shí)現(xiàn)。而順序復(fù)雜的序列要實(shí)現(xiàn)互補(bǔ),則困難得多。在核酸復(fù)性研究中,定義了一個(gè)Cot的術(shù)語,(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時(shí)間),用以表示復(fù)性速度與DNA順序復(fù)雜性的關(guān)系。在探討DNA順序?qū)?fù)性速度的影響時(shí),將溫度、溶劑離子強(qiáng)度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時(shí)間t時(shí)的復(fù)性率)對(duì)Cot作圖,可以得到所示的曲線。曲線上方為示復(fù)雜性的核酸分子的非重復(fù)堿基對(duì)數(shù)。如多聚(A)的復(fù)雜性為1,重復(fù)的(ATGC)n組成的多聚體的復(fù)雜性為4,分子長度是105核苷酸對(duì)的非重復(fù)DNA的復(fù)雜性為105.原核生物基因組均為非重復(fù)順序,故以非重復(fù)核苷酸對(duì)表示的復(fù)雜性直接體現(xiàn)基因組大小,對(duì)于真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度,400核苷酸長的片段)測(cè)得的復(fù)性率達(dá)0.5時(shí)的Cot值(稱Cot1/2),與核苷酸對(duì)的復(fù)雜性成正比。對(duì)于原核生物核酸分子,此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對(duì)的復(fù)雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復(fù)序列(repetitive sequence),所得到的Cot曲線更為復(fù)雜。

  DNA的變性和復(fù)性原理,現(xiàn)已在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用。如核酸雜交與探針技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)等。

  3.分子雜交:(hybridization)

  不同來源的核酸變性后,合并在一處進(jìn)行復(fù)性,這時(shí),只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段,復(fù)性也會(huì)發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間,形成所謂的雜化雙鏈(heterodup lex),這個(gè)過程稱為雜交(hybridization。雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間,也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。例如,一段天然的DNA和這段DNA的缺失突變體(假定這種突變是DNA分子中部丟失了若干堿基對(duì))一起雜交,電子顯微鏡下可以看到雜化雙鏈中部鼓起小泡。測(cè)量小泡位置和長度,可確定缺失突變發(fā)生的部位和缺失的多少。核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一,不僅可用來檢驗(yàn)核酸的缺失、插入,還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們?cè)谶M(jìn)化中的關(guān)系。其應(yīng)用當(dāng)然遠(yuǎn)不止于確定突變位置這一例。

  在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術(shù)稱探針技術(shù)(Probe)。一小段(例如十?dāng)?shù)個(gè)至數(shù)百個(gè))核苷酸聚合體的單鏈,有放射性同位素如32P、35S或生物素標(biāo)記其末端或全鏈,就可作為探針。把待測(cè)DNA變性并吸附在一種特殊的濾膜,例如硝酸纖維素膜上。然后把濾膜與探針共同培育一段時(shí)間,使發(fā)生雜交。用緩沖液沖洗膜。由于這種濾膜能較牢固地吸附雙鏈的核酸,單鏈的在沖洗時(shí)洗脫了。帶有放射性的探針若能與待測(cè)DNA結(jié)合成雜化雙鏈,則保留在濾膜上。通過同位素的放射自顯影或生物素的化學(xué)顯色,就可判斷探針是否與被測(cè)的DNA發(fā)生雜交。有雜交現(xiàn)象則說明被測(cè)DNA與探針有同源性(homogeneity),即二者的堿基序列是可以互補(bǔ)的。例如:想知道某種病毒是否和某種腫瘤有關(guān),可把病毒的DNA制成探針。從腫瘤組織提取DNA,與探針雜交處理后,有雜化雙鏈的出現(xiàn),就說明兩種DNA之間有同源性。這不等于可以說這種病毒引起腫瘤,但至少這是可以繼續(xù)深入研究下去的一條重要線索。

  探針技術(shù) 在遺傳性疾病診斷上已開始應(yīng)用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病,可以由已確診的病人白細(xì)胞中提取DNA,這就是診斷探針。用診斷探針檢查,不但可以對(duì)有癥狀患者進(jìn)行確診,還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。從胎兒的羊水也可以提取到少量DNA.由于探針技術(shù)比較靈敏,就使遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷較為容易辦得到了。雜交和探針技術(shù)是許多分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ),在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中,以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應(yīng)用。

編輯:songjiajie2010

 
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