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應(yīng)用Hoechst熒光染料進行DNA精確定量

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-07-26  來源:實驗室資訊網(wǎng)
核心提示: 簡介: 對微量的雙鏈 DNA 進行定量在各種生物學應(yīng)用中都顯得非常重要,例如 cDNA 文庫的構(gòu)建;用于亞克隆的 DNA 片段的純化;
   簡介:
        對微量的雙鏈 DNA 進行定量在各種生物學應(yīng)用中都顯得非常重要,例如 cDNA 文庫的構(gòu)建;用于亞克隆的 DNA 片段的純化;定量 DNA 擴增產(chǎn)物,在藥物中DNA 分子殘留的測定等 。常規(guī)的DNA含量的檢測方法是在 260nm(A260)處測其吸光值。這種方法的主要缺點是核苷酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)對信號的影響很大,并且還會受到核酸制備過程中污染物的干擾,無法區(qū)分 DNA和 RNA,而且這種方法不靈敏( 5μg/mLdsDNA溶液 A260=0.1)。
        Hoechst 染料是一種非常靈敏的熒光染料。 H33258 選擇性的與雙鏈 DNA 結(jié)合。在有蛋白的情況下熒光信號并不顯著增加,因此可檢測和定量低至 10 ng/ml 的 DNA 。                    

檢測方法:

 

2. 所需材料 

●ModulusTM單管型多功能檢測儀(貨號:9200-000或9200-002)

●紫外熒光模塊(貨號:9200-041)

●微量比色杯(貨號:7000-950)和微量適配器(貨號:9200-928)或比色杯(貨號:7000-959)

●Hoechst 33258 10 mg/ml (分子探針 H3569)

●10XTNE儲存緩沖液

●0.45μm的過濾水


3. 考慮因素 

3.1 DNA樣品中的AT含量會影響到Hoechst 33258-DNA熒光,因此,檢測樣品時設(shè)一對照是非常重要的,小牛胸腺DNA由于是雙鏈、高度聚合并含有大約58%的AT(42% GC)而經(jīng)常被用作動植物DNA的對照。對于細菌DNA來說,它會有不同的對照,因為不同菌種的AT含量變化較大。

3.2 不同構(gòu)造的質(zhì)粒DNA(超螺旋型、螺旋型、環(huán)形和、線型)會有不同的Hoechst 33258結(jié)合效果。因此,選擇一種與樣品特征相似的標準品對照也是很重要的。

3.3 在單鏈基因組DNA上的Hoechst 33258熒光只有在雙鏈基因組DNA上的一半,單鏈DAN片段的熒光量并不會與單鏈DAN的濃度成比例地引發(fā)熒光。

3.4 用于全細胞DNA抽提的緩沖液對后期的檢測沒有什么影響。

3.5 少量的去污劑(<0.01% SDS)對檢測也沒有什么影響。

3.6 含鹽濃度為3M NaCl的DNA抽提樣對檢測沒有影響。為獲得較強的熒光,純化的DNA樣品中至少要含有200mM的NaCl,未純化樣品中需含2.0-3.0M的NaCl。對于未純化樣品來講,較高的鹽濃度會將結(jié)合在DNA上的蛋白裂解下來,便于染料分子的結(jié)合。

3.7 RNA對檢測沒有影響,因為Hoechst 33258通常并不與RNA結(jié)合。來之于RNA的熒光信號通常會低于相同DNA濃度的1%。


4.試劑制備 

4.1 Hoechst 33258儲存液

        1 mg/ml Hoechst 33258:1ml的Hoechst 33258(10 mg/ml)加9ml的用0.45μm濾膜過濾的蒸餾水稀釋而成。

        注:Hoechst 33258可能會致癌和導(dǎo)致基因突變,操作時須帶手套、面罩,并且在通風櫥內(nèi)操作。

4.2 10XTNE儲存緩沖液

        溶解于800ml蒸餾水中:12.11g Tris堿[Tris(羥甲基)氨基甲烷],分子量=121.14;3.72g EDTA乙二胺四乙酸,二鈉鹽,二水合物,分子量=372.20;116.89g 氯化鈉,分子量=58.44。用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH至7.4,補加蒸餾水定容至1000ml,使用前用0.45μm濾膜過濾,4℃可保存3個月。

        注:PH和氯化鈉濃度對于Hoechst試劑和DNA的結(jié)合至關(guān)重要。

        1倍的TNE:用90ml蒸餾水(0.45μm濾膜過濾)稀釋10ml 10倍的TNE。

4.3 準配2倍的染料液用于10-1000 ng/ml的DNA:用100ml的1倍的TNE稀釋20µl Hoechst 33258 儲存液    (1 mg/ml),室溫放置,現(xiàn)用現(xiàn)配,一旦染料加入千萬別再過濾!

4.4 小牛胸腺DNA標準液:準備溶解在1倍TE濃度為1 mg/ml的小牛胸腺DNA儲存液,輕擊小管充分混勻,4℃可保存3個月。


5. 樣品檢測

5.1熒光模塊的安裝 

5.1.1關(guān)掉多功能機電源開關(guān),根據(jù)操作手冊插入紫外熒光模塊

5.1.2打開電源開關(guān),校準前先預(yù)熱1min。

5.1.3用于10X10mm比色杯的實驗方案 

5.1.3.1準備1ml 2000 ng/ml dsDNA標準液校準比色杯。

5.1.3.2以1:1的比例加2倍的染料工作液到2000 ng/ml dsDNA標準液中,終濃度為1000 ng/ml。

5.1.3.3在另外的小管中加入空白對照液:2倍的染料工作液以1:1的比例加入1X TNE緩沖液,最少2ml。

5.1.3.4校準多功能機用1000 ng/ml。

        注:用一個和檢測樣品濃度相同或相近的標準樣優(yōu)化系統(tǒng),使檢測更精確。例如,若檢測樣品濃度在300 ng/ml,要用一個500 ng/ml標準DNA樣。標準樣濃度應(yīng)該是與檢測樣濃度相同或超出100 ng/ml。

5.1.3.5保存這次校準以供將來使用(可選)

5.1.3.6向1ml樣品的小管中加1ml 2倍的染料液,需要的話,可以用1倍TNE稀釋樣品。

        注:小管中溶液體積最少需2ml。

5.1.3.7放入多功能機讀數(shù)前平衡樣品和染料混合液5min。

5.1.3.8樣品和染料濃度會在多功能機顯示屏上顯示。

        注:由于染料的加入,最終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。


5.1.4使用微量比色杯的實驗方案

5.1.4.1標準液制備。將1mg/ml 的DNA儲存液用1倍TNE稀釋到2μg/ml,加相等體積的2倍的染料工作液,而后重復(fù)步驟4.4,充分混合。

        注:用一個和檢測樣品濃度相同或相近的標準樣優(yōu)化系統(tǒng),使檢測更精確。例如,若檢測樣品濃度在300 ng/ml,要用一個500 ng/ml標準DNA樣。標準樣濃度應(yīng)該是與檢測樣濃度相同或超出100 ng/ml。

5.1.4.2空白對照液制備。在另一只小離心管中加入相同體積的樣品緩沖液(通常是1倍TNE)和2倍的染料工作液。

5.1.4.3混合小離心管中加有2倍染料工作液的樣品。

        注:在微量比色杯中不要混合檢測樣、標準樣或有染料液的空白對照液。

5.1.4.4取100μl檢測樣、標準樣和空白對照液分別加到微量比色杯中,室溫避光靜置2-5min。

        注:不要在微量比色杯中引入氣泡,它會導(dǎo)致讀數(shù)錯誤。

5.1.4.5校準多功能機用1000 ng/ml。

5.1.4.6保存這次校準以供將來使用(可選)

5.1.4.7微量比色杯中樣品所測濃度會在多功能機顯示屏上顯示。

        注:由于染料的加入,最終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。

 

 


編輯:songjiajie2010

 
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