對微量的雙鏈 DNA 進行定量在各種生物學應(yīng)用中都顯得非常重要,例如 cDNA 文庫的構(gòu)建；用于亞克隆的 DNA 片段的純化；定量 DNA 擴增產(chǎn)物,在藥物中DNA 分子殘留的測定等 。常規(guī)的DNA含量的檢測方法是在 260nm（A260）處測其吸光值。這種方法的主要缺點是核苷酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)對信號的影響很大，并且還會受到核酸制備過程中污染物的干擾，無法區(qū)分 DNA和 RNA，而且這種方法不靈敏（ 5μg/mLdsDNA溶液 A260=0.1）。

        Hoechst 染料是一種非常靈敏的熒光染料。 H33258 選擇性的與雙鏈 DNA 結(jié)合。在有蛋白的情況下熒光信號并不顯著增加,因此可檢測和定量低至 10 ng/ml 的 DNA 。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

檢測方法：

 

2. 所需材料 

●ModulusTM單管型多功能檢測儀（貨號：9200-000或9200-002）

●紫外熒光模塊（貨號：9200-041）

●微量比色杯（貨號：7000-950）和微量適配器（貨號：9200-928）或比色杯（貨號：7000-959）

●Hoechst 33258 10 mg/ml (分子探針 H3569)

●10XTNE儲存緩沖液

●0.45μm的過濾水

3. 考慮因素 

3.1 DNA樣品中的AT含量會影響到Hoechst 33258-DNA熒光，因此，檢測樣品時設(shè)一對照是非常重要的，小牛胸腺DNA由于是雙鏈、高度聚合并含有大約58%的AT（42% GC）而經(jīng)常被用作動植物DNA的對照。對于細菌DNA來說，它會有不同的對照，因為不同菌種的AT含量變化較大。

3.2 不同構(gòu)造的質(zhì)粒DNA（超螺旋型、螺旋型、環(huán)形和、線型）會有不同的Hoechst 33258結(jié)合效果。因此，選擇一種與樣品特征相似的標準品對照也是很重要的。

3.3 在單鏈基因組DNA上的Hoechst 33258熒光只有在雙鏈基因組DNA上的一半，單鏈DAN片段的熒光量并不會與單鏈DAN的濃度成比例地引發(fā)熒光。

3.4 用于全細胞DNA抽提的緩沖液對后期的檢測沒有什么影響。

3.5 少量的去污劑（＜0.01% SDS）對檢測也沒有什么影響。

3.6 含鹽濃度為3M NaCl的DNA抽提樣對檢測沒有影響。為獲得較強的熒光，純化的DNA樣品中至少要含有200mM的NaCl，未純化樣品中需含2.0-3.0M的NaCl。對于未純化樣品來講，較高的鹽濃度會將結(jié)合在DNA上的蛋白裂解下來，便于染料分子的結(jié)合。

3.7 RNA對檢測沒有影響，因為Hoechst 33258通常并不與RNA結(jié)合。來之于RNA的熒光信號通常會低于相同DNA濃度的1%。

4.試劑制備 

4.1 Hoechst 33258儲存液

        1 mg/ml Hoechst 33258：1ml的Hoechst 33258（10 mg/ml）加9ml的用0.45μm濾膜過濾的蒸餾水稀釋而成。

        注：Hoechst 33258可能會致癌和導(dǎo)致基因突變，操作時須帶手套、面罩，并且在通風櫥內(nèi)操作。

4.2 10XTNE儲存緩沖液

        溶解于800ml蒸餾水中：12.11g Tris堿[Tris（羥甲基）氨基甲烷]，分子量=121.14；3.72g EDTA乙二胺四乙酸，二鈉鹽，二水合物，分子量=372.20；116.89g 氯化鈉，分子量=58.44。用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH至7.4，補加蒸餾水定容至1000ml，使用前用0.45μm濾膜過濾，4℃可保存3個月。

        注：PH和氯化鈉濃度對于Hoechst試劑和DNA的結(jié)合至關(guān)重要。

        1倍的TNE:用90ml蒸餾水（0.45μm濾膜過濾）稀釋10ml 10倍的TNE。

4.3 準配2倍的染料液用于10-1000 ng/ml的DNA：用100ml的1倍的TNE稀釋20µl Hoechst 33258 儲存液    (1 mg/ml)，室溫放置，現(xiàn)用現(xiàn)配，一旦染料加入千萬別再過濾！

4.4 小牛胸腺DNA標準液：準備溶解在1倍TE濃度為1 mg/ml的小牛胸腺DNA儲存液，輕擊小管充分混勻，4℃可保存3個月。

5. 樣品檢測

5.1熒光模塊的安裝 

5.1.1關(guān)掉多功能機電源開關(guān)，根據(jù)操作手冊插入紫外熒光模塊

5.1.2打開電源開關(guān)，校準前先預(yù)熱1min。

5.1.3用于10X10mm比色杯的實驗方案 

5.1.3.1準備1ml 2000 ng/ml dsDNA標準液校準比色杯。

5.1.3.2以1:1的比例加2倍的染料工作液到2000 ng/ml dsDNA標準液中，終濃度為1000 ng/ml。

5.1.3.3在另外的小管中加入空白對照液：2倍的染料工作液以1:1的比例加入1X TNE緩沖液，最少2ml。

5.1.3.4校準多功能機用1000 ng/ml。

        注：用一個和檢測樣品濃度相同或相近的標準樣優(yōu)化系統(tǒng)，使檢測更精確。例如，若檢測樣品濃度在300 ng/ml，要用一個500 ng/ml標準DNA樣。標準樣濃度應(yīng)該是與檢測樣濃度相同或超出100 ng/ml。

5.1.3.5保存這次校準以供將來使用（可選）

5.1.3.6向1ml樣品的小管中加1ml 2倍的染料液，需要的話，可以用1倍TNE稀釋樣品。

        注：小管中溶液體積最少需2ml。

5.1.3.7放入多功能機讀數(shù)前平衡樣品和染料混合液5min。

5.1.3.8樣品和染料濃度會在多功能機顯示屏上顯示。

        注：由于染料的加入，最終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。

5.1.4使用微量比色杯的實驗方案

5.1.4.1標準液制備。將1mg/ml 的DNA儲存液用1倍TNE稀釋到2μg/ml，加相等體積的2倍的染料工作液，而后重復(fù)步驟4.4，充分混合。

        注：用一個和檢測樣品濃度相同或相近的標準樣優(yōu)化系統(tǒng)，使檢測更精確。例如，若檢測樣品濃度在300 ng/ml，要用一個500 ng/ml標準DNA樣。標準樣濃度應(yīng)該是與檢測樣濃度相同或超出100 ng/ml。

5.1.4.2空白對照液制備。在另一只小離心管中加入相同體積的樣品緩沖液（通常是1倍TNE）和2倍的染料工作液。

5.1.4.3混合小離心管中加有2倍染料工作液的樣品。

        注：在微量比色杯中不要混合檢測樣、標準樣或有染料液的空白對照液。

5.1.4.4取100μl檢測樣、標準樣和空白對照液分別加到微量比色杯中，室溫避光靜置2-5min。

        注：不要在微量比色杯中引入氣泡，它會導(dǎo)致讀數(shù)錯誤。

5.1.4.5校準多功能機用1000 ng/ml。

5.1.4.6保存這次校準以供將來使用（可選）

5.1.4.7微量比色杯中樣品所測濃度會在多功能機顯示屏上顯示。

        注：由于染料的加入，最終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。