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溶血空斑形成試驗

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-07-12  來源:實驗室資訊網(wǎng)
核心提示:一、原理:  溶血空斑形成試驗的基本原理是將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞混合,在補體參與下,使抗體形
 一、原理:
  溶血空斑形成試驗的基本原理是將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞混合,在補體參與下,使抗體形成細(xì)胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細(xì)胞溶解,形成肉眼可見的溶血空斑。根據(jù)所操作的方法不同可分為直接溶血空斑試驗,間接溶血空斑試驗,瓊脂固相法,小室液相法,單細(xì)胞層法等等。下面介紹直接溶血空斑形成試驗。
  二、操作步驟:
  1. 底層瓊脂平皿的制備:將1.4%瓊脂加熱融化后傾注于平皿內(nèi),每個平皿6ml,凝固后置濕盒37℃?zhèn)溆谩?/div>
2. 0.7%瓊脂加熱融化后加入華氏管內(nèi),每管2ml,47~49℃水浴保溫備用。
  3. 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液制備:用4×103 個綿羊紅細(xì)胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠,對照為等量生理鹽水。4天后,小鼠拉脫頸椎處死,取出脾臟,用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3~8×106/ml。臺盼蘭染色查活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于90%。置4℃冰箱備用。
  4. 試驗平皿的制備:依次將預(yù)溫40℃左右的25%SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細(xì)胞懸液各0.1ml加入預(yù)熱47~49℃的含0.7%瓊脂的華氏管中,迅速混勻,立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內(nèi),凝固后,置37℃孵育1小時。
5. 加入1∶5~1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5~1.0ml,使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘,即可用肉眼或借助于放大鏡進行空斑計數(shù)。
  三、試劑和器材 免疫學(xué)實驗技術(shù)論壇  http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html
 、 試劑
  1. 1.4%瓊脂:用pH7.4PBS配制。
  2. 0.7%瓊脂:用pH7.4PBS配制
3. 25%SRBC鹽水懸液
4. RPMI1640
5. 胎牛血清,56℃30分鐘滅活,并經(jīng)SRBC吸收
  6. 補體:新鮮豚鼠血清,用前經(jīng)SRBC吸收后,用RPMI1640稀釋。
  ㈡ 器材:玻璃平皿7×1.5cm,三角燒瓶,水浴箱(47~49℃),華氏管,1ml注射器,不銹鋼篩網(wǎng),青霉素瓶,離心管,不同規(guī)格加樣器等。
四、注意事項:
  1. 0.7%瓊脂必須置47~49℃水浴融態(tài)保溫。如溫度過高會導(dǎo)致SRBC溶血或所加入脾細(xì)胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發(fā)生凝固,影響上層瓊脂平板的制備
2. 離體的脾細(xì)胞應(yīng)置4℃冰箱保存,防止抗體分泌和細(xì)胞死亡。
  3. 在制備試驗平皿時,對于所有玻璃器皿和各種試劑 ,均需預(yù)溫,牭1各種試劑加入華氏管后,應(yīng)與0.7%瓊脂 迅速充分混勻,然后立即傾倒于底層瓊脂 上,并避免傾入氣泡。
  4. 加入的補體應(yīng)均勻覆蓋于表層瓊脂上。
  5. 制備底層平皿和試驗平皿時,均須將平皿置于水平臺上,以保證瓊脂面鋪平。
 
 
編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: 溶血空斑
 

 
 
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