1、網友ljksbs給出結核桿菌培養(yǎng)基配制的方法:

    結核桿菌培養(yǎng)采用羅－琴培養(yǎng)基,為防止培養(yǎng)基干裂,可加入適量甘油,我們是在1600ml的培養(yǎng)基中加入甘油12ml.

    羅－琴培養(yǎng)基成分:

    磷酸二氫鉀2.4g;一水硫酸鎂0.24g;拘掾酸鎂0.6g;天門冬素3.6g;2％孔雀綠水溶液20ml;蒸餾水600ml;馬鈴薯淀粉30g;甘油12ml;新鮮雞蛋液1000ml.

    具體配制方法如下:

1、加熱上述重量的溶解磷酸鹽,硫酸鎂,拘掾酸鎂,天門冬素和甘油于600ml蒸餾水中.

2、一邊攪拌一邊加入馬鈴薯淀粉,于沸水中水溶1小時,在置于56度水浴箱內1小時.

3、將新鮮雞蛋洗凈后,在75％乙醇中消毒30分鐘,去除后點火燒掉雞蛋外殼上的乙醇,無菌打破蛋殼,將蛋白和蛋黃收集于滅菌容器內,充分攪拌,無菌紗布過濾,在收集新鮮雞蛋液1000ml;加入上述混合液中.

4、加入滅菌的2％孔雀綠水溶液,均勻混合,分裝于滅菌的試管內,加塞封閉,斜置于血清凝固器內,85度1小時間歇滅菌2次.于冰箱保存?zhèn)溆?

二、結核桿菌的計數

1、網友benrong給出計數方案:

    結核菌生長緩慢且難于培養(yǎng),不適于用平板培養(yǎng),一是易污染環(huán)境,二是培養(yǎng)時間長了,平板會很快干掉.因此結核菌的cfu測定不能象大腸菌那樣采用平板菌落計數法.一般很少有人做結核菌的cfu計數,如果一定要做,可用Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基依次稀釋,再接種于羅氏斜面培養(yǎng)基或 Middlebrook7H10,計數可見到單菌落的培養(yǎng)斜面上的菌落數,計算出cfu.

    一般斜面面積可達4~5平方厘米,只要稀釋菌液中的活菌數足夠少,就肯定可得到可目測出的單菌落數(n).假設每個稀釋度菌液的體積為v1,接種體積為V2,則cfu/ml=n×V1×稀釋倍數/V2.

    已培養(yǎng)出的結核菌菌落,可用一玻璃試管,加幾顆玻璃珠,1ml生理鹽水,一起高壓蒸汽滅菌.然后,挑取菌落到此試管中,振搖以獲得均勻菌懸液,再稀釋成所需麥氏濁度.還可將已分純的細菌接種到7H9肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng),待菌生長后再根據你的需要稀釋成一定麥氏濁度的菌液.因Middlebrook 7H9 brooth添加了OADC及吐溫-80,不但營養(yǎng)豐富,而且細菌可呈均勻生長.

2、網友tb9981認為:

    結核菌與一般細菌不一樣,容易形成菌團,接種前應研磨均勻,制備1mg/ml菌懸液后用10倍稀釋,如果沒經驗,多接幾個稀釋度,每個稀釋度最少3 支,每支接種0.1ml,計算最后長滿的不計算,可計數稀釋度菌落就可以,一般合格培養(yǎng)基培養(yǎng)每毫克結核桿菌約1-2千萬活菌.

    如果第1次做,可以拿卡介苗(0.5mg/支)當對照(2-10百萬cfu/mg),以確定你實驗方法無誤.