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雙向電泳的實驗過程

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-06-19  來源:生物無憂
核心提示:實驗原理2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同,而將一向分離后的
 實驗原理
2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同,而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息。
主要試劑
1. BSA
2. Bradford液
3. DTT 
4. 0.05% 的溴酚蘭 
5. IPG buffer (pH 3-10)
主要設(shè)備
1. 振蕩器
2. 高速離心機
3. 紫外分光光度計
4. 雙向電泳設(shè)備
實驗材料
純化后的晶體蛋白
實驗步驟
1. 樣品的溶解
    取純化后的晶體蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右,共處理一個小時。其中每隔10~15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清分裝,每管70ul,-80oC保存。
2. Bradford法測蛋白含量
    取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。
    取7個10ml的離心管,首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液,再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水(總體積為80ul),然后,各管中分別加入4ml的Bradford液(原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用),搖勻,2min在595nm下,按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值,再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內(nèi)完成)。例如:
編號        蛋白量(ul)         Buffer(ul)         Bradford(ml)       OD595值
1                0                   80                4                0
2                5                   75                4               0.024
3               10                   70                4               0.061
4               15                   65                4               0.091
5               20                   60                4               0.116
Bt4              2                   78                4               0.079
Bt4              4                   76                4        
轉(zhuǎn)Bt4            2                   78                4               0.075
轉(zhuǎn)Bt4            4                   76                4        
標準曲線方程式:Y= aX b.其中Y為 OD值,X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數(shù)據(jù)可知,相關(guān)系數(shù)通過輸入數(shù)據(jù),作圖,軟件分析可得。
OD值測量過程:
    比色皿用70%的乙醇保存,待用時用雙蒸水沖洗,再用無水乙醇沖洗,雙蒸水沖洗,再加入待測樣品溶液潤洗,然后,加入樣品,測定OD值。
3. 雙向電泳第一向---IEF(雙向電泳中一律使用超純水)
   1) 水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT,用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm離心15min 除雜質(zhì),取上清。在含300ug 蛋白(經(jīng)驗值)的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為340ul,振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清。 
   2) 點樣,上膠
分兩次吸取樣品,每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側(cè),再用鑷子撥開Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3-10)膠條,從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意:膠條使用前,要在室溫中平衡30分鐘;加樣時,正極要多加樣,以防氣泡的產(chǎn)生;壓膠時不能產(chǎn)生氣泡;酸性端對應(yīng)正極,堿性端對應(yīng)負極;樣品加好后,加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個上樣槽必須與底線齊平。
   3)  IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定(跑膠溫度為20oC)
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共計44110vhs, 19.5小時,其中S1用于泡脹水化膠條,S2和S3用于去小離子,S4和S5用于聚焦。
   4) 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干(膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,如果為18cm的膠條要將兩頭剪去),再以超純水沖洗,濾紙吸干(再次沖洗過程也可省略),然后用鑷子夾住膠條以正極端(即酸性端)向下,負極端(即堿性端)向上,放入用來平衡的試管中(鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴酚蘭作為標記),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min。  注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時,在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片,長度與一向膠條的寬度等同,然后吸取煮好的Marker,轉(zhuǎn)入SDS—PAGE膠面上,保持緊密貼合;同樣在第二次平衡時,煮5%的瓊脂糖10ml。
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE 
   1) 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠:(T=8%  80 ml):溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED
30 % 丙烯酰胺儲液    21.28ml
分離膠buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul 
雙蒸水               38.72ml 
濃縮膠:(T=4.8%   10ml)
30 % 丙烯酰胺儲液    1.6ml 
濃縮膠buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul 
雙蒸水               5.9ml
   2) 灌膠
    將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現(xiàn)三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。
   3) 轉(zhuǎn)移
    剪兩個小的濾紙片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE膠面的一端。然后,將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉(zhuǎn)移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡。
   4) 跑膠
濃縮膠  13mA         分離膠  20mA        共約5.5個小時。
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)(銀染特別注意用超純水)
   1)  固定   30min    無水乙醇 200ml 乙酸50ml,用超純水定容至500ml。
   2)  敏化   30min    無水乙醇 150ml。
Na2S2O3•5H2O  1.5688g
無水乙酸鈉          34g  
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml。
   3)  洗滌   5min  ×  3次
   4)  銀染   20min     AgNO3   1.25g   用超純水定容至500ml
   5)  洗滌   1min  ×  2次
   6)  顯影       
無水Na2CO3    12.5g   用超純水定容至500ml,甲醛(37%)0.1ml, 臨時加。
   7)  終止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超純水定容至500ml。
   8)  洗滌   5min  ×  3次。
注意事項
整個雙向電泳實驗中全部使用超純水,盡量減少離子的影響。

編輯:songjiajie2010

 
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