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雙向電泳操作步驟及相關(guān)溶液配置

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-06-19  來源:生物無憂
核心提示:A. 實驗過程一 實驗原理: 2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同
 A. 實驗過程
一 實驗原理:
    2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同,而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離.這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息.
二 實驗步驟:
1. 樣品的溶解
    取純化后的晶體蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右,共處理一個小時.其中每隔10~15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清分裝,每管70ul,—80oC保存.
2. Bradford法測蛋白含量
    取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超純水溶解,測定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量.取 7個10ml的離心管,首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液,再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水(總體積為80ul),然后,各管中分別加入4ml的Bradford液(原來配好的 Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用),搖勻,2min在595nm下,按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值,再測樣品 OD值.(測量過程要在一個小時內(nèi)完成).
3. 雙向電泳第一向---IEF(雙向電泳中一律使用超純水)
3.1 水化液的制備
    稱取2.0mg 的DTT,用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm離心15min 除雜質(zhì),取上清.在含300ug 蛋白(經(jīng)驗值)的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為340ul,振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清.
3.2 點樣,上膠
    分兩次吸取樣品,每次170ul, 按從正極到負(fù)極的順序加入點樣槽兩側(cè),再用鑷子撥開Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3—10)膠條,從正極到負(fù)極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品.注意:膠條使用前,要在室溫中平衡30分鐘;加樣時,正極要多加樣,以防氣泡的產(chǎn)生;壓膠時不能產(chǎn)生氣泡;酸性端對應(yīng)正極,堿性端對應(yīng)負(fù)極;樣品加好后,加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個上樣槽必須與底線齊平.
3.3  IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定(跑膠溫度為20℃)
       S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
       S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
       S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
       S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
       S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共計44110vhs, 19.5小時
    其中S1用于泡脹水化膠條,S2和S3用于去小離子,S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
    用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干(膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,如果為18cm的膠條要將兩頭剪去),再以超純水沖洗,濾紙吸干(再次沖洗過程也可省略),然后用鑷子夾住膠條以正極端(即酸性端)向下,負(fù)極端(即堿性端)向上,放入用來平衡的試管中(鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴 酚蘭作為標(biāo)記),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min.  注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁.
    平衡第二次時,在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片,長度與一向膠條的寬度等同,然后吸取煮好的Marker,轉(zhuǎn)入SDS—PAGE膠面上,保持緊密貼合;同樣在第二次平衡時,煮5%的瓊脂糖10ml.
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE 
4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)
      分離膠:(T=8%  80 ml):溶液于真空機(jī)中抽氣后再加APS和TEMED
      30 % 丙烯酰胺儲液    21.28ml
      分離膠buffer           20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul
      雙蒸水                   38.72ml 
      濃縮膠:(T=4.8%   10ml)
      30 % 丙烯酰胺儲液     1.6ml
      濃縮膠buffer            2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul
      雙蒸水                   5.9ml
4.2 灌膠
      將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現(xiàn)三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保鮮膜封好.
4.3 轉(zhuǎn)移
      剪兩個小的濾紙片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE膠面的一端.然后,將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面 上(瓊脂糖凝膠在轉(zhuǎn)移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠 面,其中不斷補(bǔ)加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡.
4.4 跑膠
     濃縮膠  13mA         分離膠  20mA        共約5.5個小時
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)(銀染特別注意用超純水)
5.1  固定   30min    無水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超純水定容至500ml
5.2  敏化   30min    無水乙醇 150ml
                         Na2S2O3•5H2O  1.5688g
                         無水乙酸鈉          34g  
                         先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3  洗滌   5min  ×  3次
5.4  銀染   20min     AgNO3   1.25g   用超純水定容至500ml
5.5  洗滌   1min  ×  2次
5.6  顯影             無水Na2CO3    12.5g   用超純水定容至500ml
                       甲醛(37%)0.1ml, 臨時加
5.7  終止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超純水定容至500ml
5.8  洗滌   5min  ×  3次
    注:整個雙向電泳實驗中全部使用超純水,盡量減少離子的影響.
B實驗相關(guān)試劑配制
1.Bradford 工作液
95%乙醇             25ml       先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250,溶解完后再加磷
85%磷酸             52ml       酸,最后超純水定容至500ml.過濾后置于棕色瓶
考馬斯亮蘭G250   0.035g     外加油皮紙保存(Bradford不穩(wěn)定,一周內(nèi)有效) 
2.裂解液
尿素                 8M
硫脲                 2M
CHAPS             4%
DTT                 60 mM
Tris—base          40 mM(如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate)
3. 水化液儲液
尿素                 8M 
硫脲                 2M
CHAPS             4%
Tris—base          40 mM
4. 分離膠buffer (pH8.8)                         250ml
SDS                  0.4%                   1g
Tris—HCl           1.5M                 45.4275g
5. 濃縮膠buffer (pH6.8)                         100ml
SDS                  0.4%                  0.4g
Tris—HCl           0.5M                  6.07g
6.凝膠儲存液(30%的丙烯酰胺)               250ml
Acr                  29.2%                  73g
Bis                   0.8%                   2g
7. 電極緩沖液(跑一次要配制2500ml)
甘氨酸             43.2g                   36g
Tris                  9g         或           7.5g
SDS                 3g                      2.5g                
超純水定容至3000ml                    超純水定容至2500ml
8.0.5M Tris —HCl pH 6.8儲液
6.1g Tris先用30ml超純水溶解,再用46ml,3M HCl調(diào)pH6.8,再加水定容至100ml
9.平衡液儲液
脲(即尿素)         36g
甘油                    30%                  30ml
SDS                    1%                   1g
0.5M Tris—HCl pH6.8  10ml              超純水定容至100ml
10. 平衡液A(一根膠條)
DTT                   20mg
平衡液儲液           10ml
11.平衡液B(一根膠條)
碘乙酰氨             300mg
平衡液儲液           10ml
0.05%溴酚蘭          15ul              (平衡液A、B均需臨時配制)
12.0.5%瓊脂糖10ml
瓊脂糖                0.05g
電極緩沖液           10ml
溴酚蘭                25ul
補(bǔ):4、5、6的溶液需過濾后儲存于4℃?zhèn)溆?
 
編輯:songjiajie2010

 
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