1.用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?

 

關(guān)于漂移問題：

 

①溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定;

 

②流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等;

 

③柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡;

 

關(guān)于快速變化問題

 

①流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定;

 

②泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出;

 

③流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合;

 

2.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?

 

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子;

 

②存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子;

 

③可能柱超載，減少進(jìn)樣量;

 

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

 

①樣品量不足，解決辦法為增加樣品量;

 

②樣品未從柱子中流出�？筛鶕�(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子;

 

③樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器;

 

④檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可;

 

⑤檢測器時間常數(shù)太大，解決辦法為降低時間參數(shù);

 

⑥檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗;

 

⑦檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣;

 

⑧記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可;

 

⑨流動相流量不合適。調(diào)整流速即可;

 

⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

 

4.做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決?

 

①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理;

 

②比例閥失效，更換比例閥即可;

 

③泵密封墊損壞，更換密封墊即可;

 

④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法;

 

⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可;

 

⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

 

5.我最近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現(xiàn)，為什么?

 

這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力，盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ods填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ods柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如，三乙基胺(tea)，將會使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現(xiàn)性。如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時間的重現(xiàn)。

 

6.我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時柱壓過高，請問為什么?

 

柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因：

 

①拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查;

 

②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查;

 

③將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，(此時，不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動池)。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查;只用于使用過的柱子。

 

④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，sge提供的rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。

 

7.色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理?

 

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下(不包括梯度)，峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。下面根據(jù)本人幾年工作的體會，提出一些看法，向同仁指教。色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。

 

①色譜柱

 

如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)(出峰越快，雙峰的可能性會減少)，尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題-柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。

 

②溶劑極性及進(jìn)樣量：

 

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前，HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如，純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如，定量管為20μL，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時間會提前(相對進(jìn)樣量少而言)，將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎�常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。

 

③樣品的特性

 

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如，紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如，我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇(吡蟲清)。

 

④參數(shù)

 

記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如，c-r3a數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2MS，HPLC為5MS，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎�個峰或更多。

 

8.色譜柱中的流動相會排干嗎?

 

不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補(bǔ)充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了?色譜柱還能使用嗎?事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。

 

相比之下，另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了�？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。

 

9.使用peek(poly etheretherketone)管路和接頭需要注意什么問題?

 

如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用peek材料制成的管路和接頭會非常方便。peek管路容易連接;peek接頭不僅無需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。

 

使用此類材料的管路需要注意的是：peek對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解peek材料的明顯跡象，但，peek遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但peek管只能耐受近4000psi(但多數(shù)hplc應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會超過3000psi)。

 

使用peek接頭時則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的peek接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產(chǎn)生死體積或漏液。

 

10. 液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響

 

許多色譜工作者在操作液相色譜時，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。如果實(shí)驗(yàn)室的溫度能保持不變的話，不會有什么大問題。但大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，因此若想將在某實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的一種液相色譜方法應(yīng)用到其他實(shí)驗(yàn)室的話，溫度的差別就會引起較復(fù)雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，本文就來討論液相色譜方法中的梯度洗脫方式受溫度影響的問題。

 

等度保留

 

大多數(shù)色譜工作者知道等度洗脫時溫度會影響保留時間。擁有溫控系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室一般都有全天候溫控設(shè)置，但這種設(shè)置可能引起室溫顯著變化，這對整夜運(yùn)行的色譜系統(tǒng)就會有一些影響，例如，我們實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度就設(shè)為4～7℃。在不同的季節(jié)，實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會使色譜峰離開“保留時間窗”，造成連續(xù)進(jìn)樣中產(chǎn)生一系列的無效數(shù)據(jù)。

 

還有一個可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實(shí)驗(yàn)室的位置。當(dāng)色譜柱正對著空調(diào)的送風(fēng)口時，雖然整個實(shí)驗(yàn)室的溫度非常穩(wěn)定，但色譜系統(tǒng)的溫度就會不斷的變化。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。

 

梯度保留

 

溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般都會有較大的變化。

 

結(jié)論

 

我們發(fā)現(xiàn)柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最后，溫度的不平衡會導(dǎo)致峰扭曲變形。這些提醒我們，如果想得到穩(wěn)定可靠的分離結(jié)果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。

 

11.為何會基線漂移

 

原因

 

①柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)；

 

②流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移)；

 

③流通池被污染或有氣體;

 

④檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線);

 

⑤流動相配比不當(dāng)或流速變化；

 

⑥柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時;

 

⑦流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成;

 

⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高k’值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線；

 

⑨使用循環(huán)溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測器；

 

⑩檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處。

 

解決方法

 

①控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器;

 

②使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

 

③用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1n的硝酸。(不要用鹽酸)

 

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

 

⑤更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

 

⑥用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動相時，在分析前用10～20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。

 

⑦檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑

 

⑧改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

 

⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動相。

 

⑩將波長調(diào)整至最大吸收波長處。重選檢測波長。

 

12.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的原因

 

①在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峰)。

 

②漏液。

 

③流動相混合不完全。

 

④溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)。

 

⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲)。

 

⑥泵振動 。

 

解決方法

 

①流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。

 

②檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

 

③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

 

④減少差異或加上熱交換器。

 

⑤斷開lc、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。采用精密級穩(wěn)壓電源。

 

⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。

 

13.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的原因

 

①漏液；

 

②流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成；

 

③流動相各溶劑不相溶；

 

④檢測器/記錄儀電子元件的問題；

 

⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡；

 

⑥檢測器內(nèi)有氣泡；

 

⑦流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音）；

 

⑧檢測器燈能量不足；

 

⑨色譜柱填料流失或阻塞；

 

⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常。

 

解決方法

 

①檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。

 

②檢查流動相的組成。

 

③選擇互溶的流動相

 

④斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。

 

⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)

 

⑥清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

 

⑦用1n的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

 

⑧更換燈

 

⑨更換色譜柱

 

⑩維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置

 

14.保留時間漂移的故障排除

 

保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實(shí)上，保留時間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失(例如，通過水解)，色譜柱污染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：

 

(1)色譜柱平衡

 

如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如，離子對試劑)則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。

 

流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。

 

(2)固定相穩(wěn)定性

 

固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH=4時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。

 

經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如，氨基鍵合相等。

 

(3)色譜柱污染

 

保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來源。

 

樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)，如，配藥中的賦形劑，生化樣品(如，血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加�？梢酝ㄟ^使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。

 

避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解，如，thf可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在thf中就不能溶解。dmso常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

 

(4)流動相組成

 

流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。

 

(5)疏水坍塌

 

當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡。色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱(如，waters symmetryshield rp色譜柱)或非端基封口的色譜柱(如，waters resolve色譜柱)也可避免發(fā)生坍塌。

 

15.為何出現(xiàn)肩峰或分叉?

 

①樣品體積過大--用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%;

 

②樣品溶劑過強(qiáng)--采用較弱的樣品溶劑;

 

③柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件;

 

④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效--更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器，過濾樣品;

 

⑤進(jìn)樣器損壞--更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子

 

16.為何出現(xiàn)鬼峰?

 

①進(jìn)樣閥殘余峰--每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥，改進(jìn)閥和樣品的清洗;

 

②樣品中未知物--處理樣品;

 

③柱未平衡--重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑(尤其是離子對色譜);

 

④三氟乙酸(tfa)氧化--每天新配，用抗氧化劑;

 

⑤水污染(反相)--通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水;

 

17.為何出現(xiàn)峰拖尾?

 

①柱超載--降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相;

 

②峰干擾--清潔樣品，調(diào)整流動相;

 

③硅羥基作用--加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值，純化樣品;

 

④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效--更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過濾器，過濾樣品;

 

⑤柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件;

 

⑥死體積或柱外體積過大--連接點(diǎn)降至最低，對所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管;

 

⑦柱效下降--用較低腐蝕條件，更換柱，采用保護(hù)柱;

 

18.為何出現(xiàn)峰展寬?

 

①樣品體積過大--用流動相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%;

 

②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展--進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散;

 

③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢--設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn);

 

④檢測器時間常數(shù)過大--設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%;

 

⑤流動相粘度過高--增加柱溫,采用低粘度流動相;

 

⑥檢測池體積過大--用小體積池,卸下熱交換器;

 

⑦保留時間過長--等度洗脫時增加強(qiáng)溶劑含量，也可用梯度洗脫;

 

⑧柱外體積過大--將連接管徑和連接管長度降至最小;

 

⑨樣品過載--進(jìn)小濃度小體積樣品。

 

19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變?

 

改變流動相組成和溫度;改變柱長、柱內(nèi)徑和填料粒度;柱突然阻塞壓力升高(正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的)。

 

20.什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑?

 

改變流動相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時間。在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑為弱溶劑。

 

21.怎樣才會使峰位發(fā)生重排?

 

在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強(qiáng)度(組成百分比)而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發(fā)生峰位的重排。

 

下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：

 

流動相中換了強(qiáng)溶劑;pH值的改變;柱填料的改變;柱溫的改變;流動相的組成改變(如，加入離子對試劑三乙基胺等)。

 

22.除了在線脫氣，常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些?

 

加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持;氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多;真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失;超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但，在實(shí)驗(yàn)室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。

 

23.評價一個色譜柱的最基本指標(biāo)有那些?

 

評介一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。

 

24.什么是時間常數(shù)?

 

時間常數(shù)實(shí)際上是響應(yīng)時間的設(shè)定，起著過濾噪音的作用。時間常數(shù)太小(太快)可能增加短噪音，時間常數(shù)太大(太慢)可能出寬峰、拖尾峰。

 

25.為什么在實(shí)驗(yàn)過程中有時會出現(xiàn)倒峰?

 

所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進(jìn)在此波長下沒有吸收或吸收低于流動相的溶液，在流動相中會出現(xiàn)洞穴，通過柱后出現(xiàn)倒峰。

 

26.為何會出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰?怎樣避免?

 

用比流動相強(qiáng)度大的大體積樣品進(jìn)樣，通常會損害色譜圖的質(zhì)量，而出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰。應(yīng)遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣品：

 

a.最好用流動相溶解樣品進(jìn)樣;

 

b.用大體積弱溶劑溶解樣品，如，反相色譜中用水溶解樣品進(jìn)樣，主要缺點(diǎn)是每次進(jìn)樣后在色譜圖的開頭出現(xiàn)大的負(fù)峰，有時還波及到樣品峰;

 

c.需要時用強(qiáng)溶劑溶解進(jìn)樣。

 

27.什么是次級保留效應(yīng)?

 

在良好的色譜分離中，樣品分子是以單一的保留過程被保留，如在反相色譜中，溶質(zhì)與柱填料的非極性烷基鏈發(fā)生疏水性相互作用，但，在以硅膠為基質(zhì)的填料中，有些樣品組分能與硅醇基團(tuán)相互作用，脫附的過程很慢，使峰嚴(yán)重拖尾，這就是次保留過程。對付次保留效應(yīng)最有效的方法就是選用封尾更好色譜柱或加入流動相改良劑(也叫掃尾劑)。

 

28.前延峰的發(fā)生及處理?

 

因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。在離子對色譜中，前延峰的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進(jìn)樣量不要太大，否則會導(dǎo)致前延峰或其它問題。在rp-HPLC中樣品溶液的強(qiáng)度大于流動相引起前延峰。增加流動相的強(qiáng)度，減少樣品溶液的強(qiáng)度，在離子對色譜中增加離子強(qiáng)度，可以克服前延峰的效應(yīng)。此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單實(shí)用的方法。

 

29.峰變寬的原因?

 

a.在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效;

 

b.柱外峰寬效應(yīng)。一根很好的專用柱用于另一液相色譜系統(tǒng)引起塔板數(shù)降低，說明新系統(tǒng)有很大的柱外峰寬效應(yīng);

 

c.化學(xué)效應(yīng)，多數(shù)是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峰有所改善。

 

30.柱平衡慢的常見原因有哪些?

 

柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強(qiáng)，或者，在新的流動相中濃度小甚至為零：

 

a.流動相含有胺改良劑;

 

b.流動相含有離子對試劑;硅膠柱;流動相中有四氫呋喃�？煽紤]采用專用柱用于特殊的方法，不用時將柱折下來，注滿適當(dāng)?shù)娜軇┗蛄鲃酉�，密封保管，不再作其它的分析�?/span>

 

31.用內(nèi)標(biāo)法實(shí)驗(yàn)時對內(nèi)標(biāo)物的要求有哪些?

 

a.內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)應(yīng)與被分析組分相似或相近;

 

b.內(nèi)標(biāo)物的保留值應(yīng)稍大于或小于被分析物的保留，不能相差過大;

 

c.內(nèi)標(biāo)物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度(r大于1.5)，不能讓內(nèi)標(biāo)物成了干擾物;

 

d.無結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)標(biāo)物，可用保留相近的內(nèi)標(biāo)物;

 

e.儀器對分析物的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。

 

32.管子切割與安裝注意事項(xiàng)?

 

a.管子的斷面必須垂直，否則，將會產(chǎn)生死體積而引起色譜峰峰形擴(kuò)展。

 

b.確保管子內(nèi)表面不被損傷，如果損傷，可能會發(fā)生管路堵塞。

 

c.將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則，將會產(chǎn)生死體積而引起色譜峰峰形擴(kuò)展。

 

d.不要過分?jǐn)Q緊螺帽，以防損壞螺紋。

 

33.什么是HPLC的“無限直徑效應(yīng)”?

 

在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴(kuò)散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內(nèi)壁接觸，因而引起的色譜峰形擴(kuò)展很小，能保持高柱效。

 

34.如何評價一臺檢測器?

 

a.噪聲：

 

通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無規(guī)則波動;

 

b.基線飄移：

 

漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間(0.5~1h)內(nèi)觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統(tǒng)有關(guān)，而不僅是由檢測器引起的;

 

c.靈敏度(最小檢出濃度或最小檢出量)：

 

在一個特定分離工作中， 檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當(dāng)比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標(biāo)。敏感度即指信號與噪聲的比值(信噪比)等于2時，在單位時間內(nèi)進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量。

 

d.線性范圍：

 

在進(jìn)行定量分析時，希望檢測器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進(jìn)行檢測;

 

e.檢測器的池體積：

 

它應(yīng)小于最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產(chǎn)生嚴(yán)重的柱外譜帶擴(kuò)展。

 

35.如何簡單判斷比例閥是否內(nèi)漏?

 

設(shè)定泵使用一個單獨(dú)通路(a)，打開purge閥，流速5mL/min，提起其他溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路(b、c、d)內(nèi)的溶劑是否隨著流動，正常時均不應(yīng)流動。