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金黃色葡萄球菌檢測,不看就out了

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2023-07-31
核心提示: 金黃色葡萄球菌 第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗01操作步驟·樣品的處理 稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯無
 
金黃色葡萄球菌

 

第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗

01

操作步驟

·樣品的處理 

稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~ 2min。若樣品為液態(tài),吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,振蕩混勻。

 

·增菌 

將上述樣品勻液于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁 生長。 

 

·分離 

將增菌后的培養(yǎng)物,分別劃線接種到 Baird-Parker平板和血平板,血平板36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~ 24h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24h~48h。

 

·初步鑒定

金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2mm~3mm, 顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰 帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清 晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些, 且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。

 

 

在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

 

 

·確證鑒定 

1.染色鏡檢:金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約為 0.5μm~1 5 μm。 

 

2.血漿凝固酶試驗:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個可疑菌落(小于5個全選),分別接 種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24h。

取新鮮配制兔血漿0.5 mL,放入小試管中,再加入 BHI培養(yǎng)物0.2 mL~0.3 mL,振蕩搖勻,置 36 ℃±1 ℃溫箱或水浴箱內(nèi),每半小時觀察一次,觀察6h,如呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現(xiàn) 凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌 菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進(jìn)行血漿凝固酶試驗。結(jié)果如可疑,挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~48h,重復(fù)試驗。 

 

02

結(jié)果報告

結(jié)果判定:符合4、5,可判定為金黃色葡萄球菌。

結(jié)果報告:在25g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。 

 

03

注意要點(diǎn)

1.7.5%氯化鈉肉湯增菌培養(yǎng):

(1)若樣品本身在均質(zhì)后清澈,培養(yǎng)18h觀察呈現(xiàn)一定程度的渾濁(與培養(yǎng)前相比),則接種平板;若18h后仍無變化,繼續(xù)培養(yǎng)至24h后無論渾濁與否都接種至平板;

 

(2)若樣品本身在均質(zhì)后渾濁,則直接培養(yǎng)至24h后再接種平板。

 

2.血平板:36±1℃培養(yǎng)18h后觀察,若有菌落生長或有菌落生長的跡象(無論是否溶血),則應(yīng)酌情配制NA、BHI并分裝至小試管中(NA 10mL/管、BHI 5mL/管)、滅菌后NA應(yīng)斜放凝固成瓊脂斜面?zhèn)溆谩V裂桨迮囵B(yǎng)至24h取出,挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,同時挑取菌落接種至NA斜面、BHI肉湯管,36±1℃培養(yǎng)24h。

 

3.接種原則:

(1)革蘭氏染色后還剩余10個或10個以上菌落,則NA、BHI分別接種5管;

 

(2)若多于5個(不包括5個)不足10個,則BHI接種5管,剩余的接種NA;

 

(3)5個及以下則全部接種BHI,不接種NA。

 

4.BP平板

36±1℃培養(yǎng)24h后觀察,有菌落生長則取出,無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察。若血平板已挑取菌落進(jìn)行證實試驗,則不必再挑取BP平板上的菌落進(jìn)行實驗。若血平板上無菌落生長,則應(yīng)在24h~48h內(nèi)逐步觀察BP平板是否長菌或有無長菌跡象,有則需配置BHI及NA,挑取BP上的菌落進(jìn)行純化、增菌,36±1℃培養(yǎng)24h。 

 

5.血漿凝固酶試驗:

(1)根據(jù)BHI管數(shù),取凍干血漿粉,每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水,使其充分溶解,再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養(yǎng)物加入其中(每管BHI用1個槍頭),振蕩搖勻后于36±1℃培養(yǎng),計時,每30min觀察一次,如呈現(xiàn)凝固(將試管傾斜或倒置時出現(xiàn)凝塊)或半凝固(一般的液體呈現(xiàn)凝固)則判定為陽性。若一直不凝固,則一直觀察,直至觀察至6h(查看12次)還未凝固,則試驗終止,判定為陰性結(jié)果;若中途出現(xiàn)完全凝固或半凝固,則試驗終止,判定為陽性結(jié)果。

 

(2)同時取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 6538以及CMCC(B)26003各一支)制成菌懸液后作為陽性對照、以滅菌生理鹽水為陰性對照,分別接種至BHI中同步培養(yǎng)后進(jìn)行血漿凝固酶試驗。

(3)若血漿凝固酶試驗結(jié)果可疑,則挑取NA上的菌落接種BHI再次進(jìn)行試驗。

 

第二法 金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法

 

 

01

操作步驟

·樣品的稀釋 

1.固體和半固體樣品:稱取25g樣品置于盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯 內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或置于盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中,用拍 擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。 

 

2.液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形 瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。 

3.用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9mL磷酸鹽 緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL 無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。 

4.按3操作程序,制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1次1mL無菌吸管或 吸頭。

 

·樣品的接種  

根據(jù)對樣品污染狀況的估計,選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進(jìn) 行10倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別 加入三塊 Baird-Parker平板,然后用無菌涂布棒涂布整個平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如 Baird-Parker平板表面有水珠,可放在25 ℃~50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。  

 

·培養(yǎng)  

培養(yǎng) 在通常情況下,涂布后,將平板靜置10min,如樣液不易吸收,可將平板放在培養(yǎng)箱36 ℃±1 ℃培 養(yǎng)1h;等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板,倒置后于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24h~48h。 

 

·典型菌落計數(shù)和確認(rèn)

 

1.金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為 2 mm~ 3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一 清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈 和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺 些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。 

2.選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20CFU~ 200CFU 之間的平板,計數(shù)典型菌落數(shù)。

 

3.從典型菌落中至少選5個可疑菌落(小于5個全選)進(jìn)行鑒定試驗。分別做染色鏡檢,血漿凝固酶試驗;同時劃線接種到血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h后觀察菌落形態(tài),金黃色葡萄球菌 菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。 

 

02

結(jié)果計數(shù)

1.若只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20CFU~200CFU 之間,計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。 

2.若最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)小于20CFU,計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。

3.若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,計數(shù)該稀釋 度平板上的典型菌落,按式(1)計算。

 

4.若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU,而下一稀釋度平板上雖有 典型菌落但不在20CFU~200CFU 范圍內(nèi),應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。 

5. 2個連續(xù)稀釋度的平板典型菌落數(shù)均在20CFU~200CFU 之間,按式(2)計算。 

計算公式

 

 

03

結(jié)果報告

根據(jù)上面的公式計算結(jié)果,報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌數(shù),以 CFU/g(mL)表示;如T 值為 0,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。 

 

04

注意要點(diǎn)

1.取1mL樣品稀釋勻液接種3個BP平板(此處并未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣,由于如此操作會增加試驗時間,無法在15min內(nèi)完成試驗)。

2.涂布時不要觸及平板邊緣(會導(dǎo)致樣液涂抹不均勻,大部分匯集于邊緣)。

3.可用同一根涂布棒從低稀釋度到高稀釋度進(jìn)行涂布(不用換涂布棒)。

4.涂布完成后應(yīng)稍微放置一段時間使培養(yǎng)基吸收樣品勻液。

5.若水珠較多,可正置于培養(yǎng)箱中1~2h后再倒置培養(yǎng)。

6.36±1℃培養(yǎng)24h后觀察,有典型菌落生長則進(jìn)行證實試驗(革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板)。若無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察,有典型菌落生長則進(jìn)行證實試驗,無典型菌落生長則試驗終止。

 

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數(shù)法

 

01

操作步驟

同第二法

02

接種培養(yǎng)

1.根據(jù)對樣品污染狀況的估計,選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進(jìn)行 10倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別接種 1 mL 樣品勻液至 7.5% 氯化鈉肉湯管(如接種量超過 1mL,則用雙料7.5%氯化鈉肉湯),每個稀釋度接種3管,將上述接種物36℃±1℃培養(yǎng),18h~24h。 

2.用接種環(huán)從培養(yǎng)后的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán),移種于Baird-Parker平板36℃ ±1 ℃培養(yǎng),24h~48h。

03

典型菌落確認(rèn)

第二法

04

結(jié)果報告

根據(jù)證實為金黃色葡萄球菌陽性的試管管數(shù),查MPN檢索表,報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù),以 MPN/g(mL)表示。

05

注意要點(diǎn)

1、樣品稀釋同菌落總數(shù),取3個連續(xù)稀釋度稀釋液(或包括液體樣品原液),每個稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯,每管接種1mL,36±1℃培養(yǎng)18h后觀察,若出現(xiàn)渾濁則接種至BP平板,若無變化則繼續(xù)培養(yǎng)至24h后再接種至BP平板。

 

2、劃線接種至BP平板,36±1℃培養(yǎng)24h后觀察,有典型菌落生長則進(jìn)行證實試驗(革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板)。若無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察,有典型菌落生長則進(jìn)行證實試驗,無典型菌落生長則試驗終止。

 

3、根據(jù)證實后的陽性管數(shù)差MPN表得出結(jié)果。


編輯:songjiajie2010

 
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