MPN法作為實(shí)驗(yàn)室微生物定量檢測(cè)常用有效的方法之一,但是很多檢測(cè)人員對(duì)MPN法的理解太膚淺、不充分,導(dǎo)致在使用MPN法的時(shí)候存在很多錯(cuò)誤的認(rèn)識(shí),有時(shí)還容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤。針對(duì)這些問(wèn)題,今天我們就一起來(lái)聊聊“MPN法的原理、應(yīng)用過(guò)程中注意事項(xiàng)”!
還記得剛畢業(yè)后,我就來(lái)到一個(gè)做大豆制品的公司,入職成了一名光榮的微生物化驗(yàn)員,在工作的第一天,化驗(yàn)室的師父就給我簡(jiǎn)單介紹了每天的大致工作任務(wù)。
在工作的第二天,我就很納悶“菌落是怎么形成的、什么是MPN?”,于是我就鼓足勇氣說(shuō):“師父,我有個(gè)問(wèn)題想問(wèn)你,什么是MPN”
師父回答:“最大可能數(shù)”,眼皮都沒(méi)有抬一下。
我想了想,又膽怯的問(wèn):“那啥是最大可能數(shù)?”
師父提高了嗓門(mén),回答:“是一種用統(tǒng)計(jì)學(xué)算出來(lái)的樣品中最可能的數(shù)!”
我又想了想,又問(wèn):“這個(gè)數(shù)有什么意義?它是怎么算的?”
師父猛地抬起頭,眉頭緊鎖地回了一句:“今天的培養(yǎng)皿都洗了么?三角瓶呢?培養(yǎng)基滅了沒(méi)?夠用嗎?......”
我聽(tīng)聞,溜溜的去干活去了,但是還是沒(méi)弄明白。后來(lái)就聽(tīng)見(jiàn)師父自言自語(yǔ)說(shuō),誰(shuí)能告訴我啊,什么是MPN,我也有點(diǎn)蒙......”
要想說(shuō)清楚MPN,首先要了解MPN法的概念。
MPN(most probable number)法:即最近似數(shù)法,也稱(chēng)為最大可能數(shù)法,是食品檢驗(yàn)中常用的方法。1915年,McCrady首次發(fā)表了用MPN法 (最大可能數(shù)法) 來(lái)估算細(xì)菌濃度的方法, 這是一種應(yīng)用概率理論來(lái)估算細(xì)菌濃度的方法。
•MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長(zhǎng)的最低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
•MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù), 實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn),MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn)。
MPN法:適用于具有特殊生理功能的微生物類(lèi)群或者未經(jīng)處理的含少量菌的食品。
•MPN法適用性廣,與很多種類(lèi)的食品的微生物限量要求方法一致,是常用有效的方法;
•靈敏度較高,適用于污染菌落較少的樣品;
•測(cè)定MPN值時(shí),要考慮陽(yáng)性管數(shù);
相同的MPN值,代表的實(shí)際菌落數(shù)范圍卻有很大的差別。假如你的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)為10MPN/ g,實(shí)測(cè)值為9.4MPN/g(陽(yáng)性管數(shù)“0-3-0”),那么很難判定你的產(chǎn)品是否合格。
•MPN值非連續(xù);
•MPN值的準(zhǔn)確度隨Pmax的減小而減小。
現(xiàn)在,明白了么?MPN值就是在現(xiàn)有因素下能推算出的微生物含量概率最大的那個(gè)濃度。接下來(lái)我們以大腸菌群檢測(cè)為例一下其應(yīng)用的注意事項(xiàng)和要點(diǎn)!
1.MPN法注意事項(xiàng):
•全過(guò)程不得超過(guò)15min。原因是大腸菌群在適宜條件下繁殖很快,15min就可以繁殖一代。
•樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5~7.5之間。
•接種量是MPN法成功與否的關(guān)鍵,一方面接種量要適當(dāng)以便于出現(xiàn)全陽(yáng)性和全陰性的稀釋度,另一方面接種量必須準(zhǔn)確。MPN表和MPN計(jì)算公式都是和接種量密切相關(guān)的。而培養(yǎng)基的體積是多少并不重要,只要接種后培養(yǎng)基濃度接近正常濃度(單倍濃度)就可以了。通常接種稀釋液的體積是1 mL,這個(gè)體積必須準(zhǔn)確,而培養(yǎng)基的量是10mL還是9mL影響不大。
•以48h±2h為最終觀察結(jié)果時(shí)限。大腸菌群結(jié)果也以此時(shí)為最終結(jié)果,但是原始記錄要體現(xiàn)24小時(shí)的培養(yǎng)結(jié)果記錄。
•MPN值是基于統(tǒng)計(jì)的估計(jì)結(jié)果, MPN值是可能性最大的一個(gè)估計(jì)值,其95%置信區(qū)間有95%的可能包括真實(shí)結(jié)果。結(jié)果報(bào)告的MPN值要結(jié)合95%置信限來(lái)理解, MPN結(jié)果實(shí)際上是一個(gè)結(jié)果分布。
給一個(gè)例子來(lái)理解MPN結(jié)果吧!
【例】 GB 4789.3-2016 中表B. 1接種量0. 1 g、0.01 g和0.001 g對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性管數(shù)2、 2、0。產(chǎn)品限量是“<20 MPN/g"。此產(chǎn)品合不合格?
查表得MPN值為“21MPN/g",其上、下95%置信限分別
為“4.5MPN/g"和“42MPN/g"。即每克樣品中21個(gè)大腸菌群,有95%的可能結(jié)果分布在每克4.5(下限)個(gè)至42個(gè)(上限)之間。換句話說(shuō),接種量0.1g、0.01 g和 0.001 g對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性管數(shù)2、2、0的100次檢測(cè)中,有95個(gè)結(jié)果在每克4.5個(gè)至42個(gè)之間,其中每克21個(gè)的結(jié)果次數(shù)最多。
2.MPN檢索表的應(yīng)用
•MPN(最可能數(shù)most probable number)是表示樣品中活菌密度的估測(cè)。因此MPN值只是活菌密度的估算值,并不是樣品中活菌數(shù)的真值。
3.使用MPN檢索表的注意點(diǎn)
•這個(gè)MPN檢索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北歐等標(biāo)準(zhǔn)通用的。
•表里的數(shù)字是有小數(shù)點(diǎn)的。
•當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無(wú)法查找到MPN值時(shí),如:陽(yáng)性管數(shù)為122,123,232,233等時(shí),建議增加稀釋度(可做4~5個(gè)稀釋度),使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定,則多加一稀釋度),然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找,最終確定MPN值。