不同的細(xì)菌，或者由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同一，所以所使用的染料也有差異，但是簡單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片，制成需要觀察的玻片后，使用相對應(yīng)的染料滴加到玻片上菌膜區(qū)域，以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求，結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時(shí)間，染色時(shí)間到達(dá)時(shí)，進(jìn)行水洗，干燥等步驟(見圖5-2)。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過程。

二、芽孢染色法

芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子，這些孢子耐高溫、干旱及有毒化學(xué)試劑。內(nèi)孢子還能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入，在革蘭氏染色法涂片染色時(shí)，革蘭氏陽性菌的芽孢呈現(xiàn)無色。然而，芽孢一旦著色后就很難脫色。

雖然芽孢通常可在革蘭氏染色片中看到(芽孢由于不易讓染料進(jìn)入多呈現(xiàn)無色),但在不易清晰觀察時(shí)，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色，更便于觀察。其實(shí)驗(yàn)的操作方法與革蘭氏染色類似。主要的芽孢染色法有以下兩種。

(一)孔雀綠染色法

(1)將生有芽孢的斜而菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和孔雀綠水溶液(約為

7.6%)染10 min。

(2)用自來水沖洗。

(3)用0.5%番紅液復(fù)染30%.

(4)水洗，吸干。

(5)鏡檢：芽孢呈綠色，菌體和芽抱囊呈微紅色，但應(yīng)注意菌體中有異染粒時(shí)，也可呈綠色。

(二) 石炭酸復(fù)紅染色法

(1)按常規(guī)涂片。

(2)滴加石炭酸復(fù)紅于涂片上，并于玻片下緩緩加熱，使染液冒蒸氣但不沸騰，并繼續(xù)滴加染液，不使涂片上染液蒸干，這樣保持5 min。

(3)涂片冷卻后，傾去染液，用酸性乙醇脫色至無紅色染劑洗脫為止。

(4)徹底水洗。

(5)用呂氏美藍(lán)復(fù)染2 min -3 min。 

(6)水洗、吸干。

(7)鏡檢：鏡檢時(shí)，菌體及孢囊呈藍(lán)色，芽孢呈紅色。

具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，在對一些特殊芽孢染色時(shí)，需要對染色液和復(fù)染液進(jìn)行修改。

三、鞭毛染色

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動器官，非常纖細(xì)，直徑一般為10nm~20 nm,超出了光學(xué)顯微鏡的觀察極限，因此通常情況下在顯微鏡下觀察不到鞭毛。通過使用特殊的染色技術(shù)，可以將染色液附加到鞭毛的周圍，增加它的直徑，從而能夠在光學(xué)顯微鏡下觀察到鞭毛，而且能檢測鞭毛在細(xì)菌中的分布。尤其是鞭毛染色可用于區(qū)分假單胞菌科的一些有兩極鞭毛的細(xì)菌和腸桿菌科有周身鞭毛的細(xì)菌(在運(yùn)動時(shí))。

鞭毛十分細(xì)小，很容易從細(xì)菌上脫離，所以要得到非常滿意的鞭毛染色玻片十分困難。另外，很多染色方法會產(chǎn)生沉淀物，這又使得觀察鞭毛十分困難。

鞭毛染色一般分為兩類：一種是銀鹽法，使銀在鞭毛上堆積；另一種是使用復(fù)紅沉積在鞭毛上。

(一)銀鹽沉積法(改進(jìn)的Fontana方法)

應(yīng)使用絕對干凈(無油脂)的載玻片進(jìn)行染色，最好是新的無油載玻片。用過的載玻片要在酪酸洗液中浸泡，并用蒸餾水沖洗干凈后方可再次使用。

細(xì)菌在瓊脂斜面上，比最佳生長溫度低3℃~5℃的溫度下培養(yǎng)，可在斜面上加1滴~2滴滅菌的生理鹽水保持濕度。

(1)將載玻片在火焰上快速灼燒5s,放在染色架上冷卻，用蠟筆分成兩個區(qū)域(用鑷子夾住載玻片的一端)。

(2)用移液管或巴斯德移液管移取2mL無菌水加入到幼齡(通常為18 h)、生長活躍的斜面菌株中，慢慢振蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮。建議盡量避免使用接種環(huán)。然后轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，通過懸滴試驗(yàn)檢查菌體的運(yùn)動性。用無菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止。放入20 ℃ -30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,然后移取一滿環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端。傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫的中心線。在空氣中自然干燥，不要加熱玻片。

(3)用媒染色劑媒染5 min。

(4)慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液。

(5)用熱的Fontana銀液覆蓋，染色5 min,每隔1 min更換1次染色液( Fontana銀液在沸水浴中加熱)。細(xì)菌涂層的每一部分都始終要浸在染色液中，不能裸露。

(6)用水沖洗，在空氣中晾干，鏡檢。

(二) Leifson替代染色法

下述Leifson鞭毛染色法可以代替上述方法的(3) ~(6)。

(1)滴加1 ml的Leifson鞭毛染色液，注意不要使染色液干燥，直到玻片上形成細(xì)微的鐵銹色沉淀(約10 min) 。

(2)慢慢地用蒸餾水充分沖洗干凈。

(3)用1%的亞甲基藍(lán)復(fù)染5 min ~10 min。

(4)用水洗凈，空氣中干燥，鏡檢。沒有復(fù)染時(shí)，細(xì)胞和鞭毛都呈現(xiàn)桃紅色，復(fù)染后，細(xì)胞染成藍(lán)色，鞭毛染成紅色。

實(shí)驗(yàn)中需要注意的是鞭毛很容易脫落，若觀察時(shí)視野中大多為周身鞭毛細(xì)胞，說明該菌是周毛菌，但若觀察到一個明顯的極端鞭毛細(xì)胞時(shí)，并不一定說明不是周毛菌。

注意事項(xiàng)：

(1)適宜的培養(yǎng)基、溫度和通氣條件下，以短期內(nèi)多次連續(xù)接種培養(yǎng)的幼齡菌種鞭毛情況最好。因此，用于鞭毛染色的菌種常常用幼齡菌，菌齡老化或某些培養(yǎng)條件變化常導(dǎo)致鞭毛脫落或喪失。

(2)玻片應(yīng)清潔無油污。鞭毛非常纖細(xì)且容易脫落，故操作過程動作要輕。

(3)染色法的染料須當(dāng)日配制， 4 h內(nèi)效果最好。所以鞭毛染色液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

四、莢膜染色

莢膜是某些細(xì)菌在新陳代謝過程中形成的，分泌于細(xì)胞壁外的一層膠狀黏液性物質(zhì)，主要化學(xué)成分是多糖類物質(zhì)。莢膜的折光性低，易溶于水，與染料親和力低，但莢膜的通透性比較好，某些染料可透過莢膜而使菌體著色。因此染色后在菌體周圍有一淺色或無色的透明圈，即為莢膜。一般采用負(fù)染色的方法，使背景與菌體之間形成一透明區(qū)，將菌體襯托出來便于觀察分辨，故又稱襯托法染色。因莢膜薄，且易變形，所以不能用加熱法固定。

具體操作步驟(見圖5-8)。

(一)制片

加1滴6%葡萄糖水溶液于載玻片一端，無菌操作，挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72 h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合。

(二)推片法制片

加1滴墨汁充分混勻。用推片法制片，將菌液鋪成薄層， 自然干燥。

(三)固定

滴加1滴~2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定1 min, 自然干燥；也可以不加處理， 自然干燥。

注意：不能用火加熱干燥。

(四)結(jié)晶紫染色

在已自然晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色。

(五)沖洗

2 min后，以20%硫酸銅沖洗數(shù)次。再用自來水沖洗1次。

(六)拭干水分后鏡檢

用擦鏡紙拭干水分后鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。無莢膜的菌，由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能出現(xiàn)一圈狹窄的不著色環(huán)，但這不是莢膜，莢膜不著色的部分寬。

五、死活染色

在顯微鏡下活細(xì)胞細(xì)胞膜完整、立體感強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)透明度好，顆粒狀物質(zhì)少；死細(xì)胞膜破裂，無立體感，細(xì)胞通透性差，有顆粒狀物質(zhì)、空泡。

染色排除法是生物研究中判斷細(xì)胞活性的一種常用方法，簡便，易于操作，實(shí)驗(yàn)是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來進(jìn)行的。原理：因?yàn)榛罴?xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過性，細(xì)胞不需要的物質(zhì)通常不進(jìn)入細(xì)胞，染色劑中如臺盼藍(lán)能進(jìn)入死細(xì)胞，從而可以使死細(xì)胞染色。依此染色便可以判斷細(xì)胞的活性。

活細(xì)胞必須要通過控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞膜來保持內(nèi)部生理環(huán)境的穩(wěn)定性。細(xì)胞死后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，原先不能進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)也能夠進(jìn)入細(xì)胞。常見的細(xì)胞染料有：中性紅、臺盼藍(lán)、甲基藍(lán)、美藍(lán)、熒光素雙乙酸酯等。臺盼藍(lán)染料正常情況下被活細(xì)胞攔在細(xì)胞膜外，只有細(xì)胞膜受損或者細(xì)胞死亡后，才能進(jìn)入細(xì)胞，從而與解體的DNA結(jié)合，使其著色，因此，活細(xì)胞一般不被臺盼藍(lán)染色，而死細(xì)胞會被染成藍(lán)色。通過顯微鏡觀察很容易識別出死亡的染色細(xì)胞，并可用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

用美藍(lán)染色液可以對酵母菌細(xì)胞進(jìn)行死活染色鑒別。美藍(lán)是一種弱氧化劑，氧化態(tài)呈藍(lán)色，還原態(tài)呈無色�；畹慕湍敢�?yàn)樾玛惔�謝不斷進(jìn)行，具有一定的還原能力，能將進(jìn)入細(xì)胞的美藍(lán)還原，而細(xì)胞不染色。因此，用美藍(lán)對酵母細(xì)胞染色一定時(shí)間后，無色的為活細(xì)胞，藍(lán)色的為死細(xì)胞。需要注意的是：一個活細(xì)胞的還原能力是有限的，必須嚴(yán)格控制染色的時(shí)間和染料的濃度。

方法：取0.1%美藍(lán)液一滴，滴在玻片中央，加一滴酵母菌懸液，混勻。染色3 min ~5 min后，加蓋片制成水浸標(biāo)本片，即可鏡檢，這種方法也適用于細(xì)菌和霉菌。