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微生物檢測(cè)基礎(chǔ)知識(shí)匯總(包含接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)等)!

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2018-02-28  來源:食品實(shí)驗(yàn)室服務(wù)微信公眾號(hào)
核心提示:微生物接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)等技術(shù)知識(shí)匯總!
 接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)


一、接種
將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。


接種和分離工具

1
.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀


常用的接種方法有以下幾種:
1)劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動(dòng),就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán),接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。


2)三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上,成等邊三角形的三點(diǎn),讓它各自獨(dú)立形成菌落后,來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外,也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。


3)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí),用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是:用接種針蘸取少量的菌種,沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺,如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng),則在穿刺線周圍能夠生長(zhǎng)。


4)澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中,然后再倒入冷卻至45°c左右的固體培養(yǎng)基,迅速輕輕搖勻,這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后,置合適溫度下培養(yǎng),就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。


5)涂布接種 與澆混接種略有不同,就是先倒好平板,讓其凝固,然后再將菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布,讓菌液均勻分布,就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。


6)液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下,倒入液體培養(yǎng)基中,或者從液體培養(yǎng)物中,用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中,或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中,都可稱為液體接種。


7)注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi),如人或其它動(dòng)物中,常見的疫苗預(yù)防接種,就是用注射接種,接入人體,來預(yù)防某些疾病。


8)活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法,因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物;也可以是某個(gè)離體活組織,例如猴腎等;也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射,也可以是拌料喂養(yǎng)。


無菌操作
培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后,用經(jīng)過滅菌的工具(如接種針和吸管等)在無菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養(yǎng)基上,這個(gè)過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。
(1)
接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞。


二、分離純化
含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(mixed culture)。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞,那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)(pure
culture
)。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí),所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化,方法有許多種。


1、傾注平板法
首先把微生物懸液通過一系列稀釋,取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40-50°左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合,然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中,待凝固之后,把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落,取單個(gè)菌落制成懸液,重復(fù)上述步驟數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)物。


2、涂布平板法
首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂,取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上,經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。


3、平板劃線法
最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多,常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí),接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋,最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng),每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。


4、富集培養(yǎng)法
富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng),在這些條件下,所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。如果要分離一些專性寄生菌,就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中,使其大量生長(zhǎng)。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

5、厭氧法
在實(shí)驗(yàn)室中,為了分離某些厭氧菌,可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器,把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘,以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻,并進(jìn)行接種。接種后,加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面,使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是,在接種后,利用n2co2取代培養(yǎng)基中的氣體,然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌,可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上,然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

三、培養(yǎng)
1
、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣,可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。
好氧培養(yǎng):也稱好氣培養(yǎng)。就是說這種微生物在培養(yǎng)時(shí),需要有氧氣加入,否則就不能生長(zhǎng)良好。在實(shí)驗(yàn)室中,斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩,使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。


厭氧培養(yǎng):也稱厭氣培養(yǎng)。這類微生物在培養(yǎng)時(shí),不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中,最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法:
a.
降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位:常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等,加入到培養(yǎng)基中,便可達(dá)到目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中,也可適合厭氧菌的生長(zhǎng)。
b.
化合去氧:這也有很多方法,主要有:用焦性沒食子酸吸收氧氣;用磷吸收氧氣;用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣;用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣;用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。
c.
隔絕阻氧:深層液體培養(yǎng);用石蠟油封存;半固體穿刺培養(yǎng)。
d.
替代驅(qū)氧 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣;用氮?dú)怛?qū)代氧氣;用真空驅(qū)代氧氣;用氫氣驅(qū)代氧氣;用混和氣體驅(qū)代氧氣。
2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài),可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。



微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察
1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀察,直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性,根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。


2、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種
的細(xì)菌在一定條件下,培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此,微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

1)細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容:在固體培養(yǎng)基上,觀察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。)

常見的細(xì)菌的培養(yǎng)特征
1.
點(diǎn)狀 2.圓形 3.絲狀 4.不規(guī)則形 5.假根狀 6.紡錘狀 7.扁平 8.隆起 9.凸起10.墊狀 11.臍狀 12.邊緣整齊 13.波狀 14.裂片狀 15.嚙蝕狀 16.絲狀 17.發(fā)狀 18.絲線狀 19.刺毛狀 20.串珠狀 21.疏展?fàn)?/span> 22.樹根狀 23.假根狀 24. 25.串珠狀 26.乳頭狀 27.絨毛狀 28.樹根狀 29.量杯狀 30.蘿卜狀 31.漏斗 32.囊狀 33.層狀 34.絮狀 35.環(huán)狀 36.蹼狀 37.膜狀。


2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征:
大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體,在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似,只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似,有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的絲狀體,菌絲粗長(zhǎng),在條件適宜的培養(yǎng)基里,菌絲無限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色,因而菌落邊緣和中心,正面和背面顏色常常不同,如青霉菌:孢子青綠色,氣生菌絲無色,基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。


二、生理生化試驗(yàn)
微生物生化反應(yīng):指用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物,生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。


微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有:
1、糖酵解試驗(yàn)
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。
試驗(yàn)方法:以無菌操作,用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許,接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管,若為半固體培養(yǎng)基,則用接種針作穿刺接種。接種后,置36±1.0℃養(yǎng),每天觀察結(jié)果,檢視培養(yǎng)基顏色有無改變(產(chǎn)酸),小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性,若為半固體培養(yǎng)基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力,若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長(zhǎng)。
本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力,從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別,因而每次試驗(yàn),常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍(lán)和an-drade指示劑。


2、淀粉水解試驗(yàn)
某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍(lán)色。
試驗(yàn)方法:18~24h的純培養(yǎng)物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板(一個(gè)平板可分區(qū)接種,試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物)或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1℃培養(yǎng)24~48h,或于20℃培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面,若為液體培養(yǎng)物,則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果,陽性反應(yīng)(淀粉被分解)為瓊脂。培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。
淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程,因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間,培養(yǎng)基含有淀粉量和ph等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基ph必須為中性或微酸性,以ph7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時(shí)制備為妥。


3、v-p試驗(yàn)

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱vp+)反應(yīng)。
試驗(yàn)方法:
1)o’meara氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1℃培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液1mlo’meara試劑(加有0.3%肌酸creatine或肌酸酐creatinine40%氫氧化鈉水溶液)1ml,搖動(dòng)試管1~2min,靜置于室溫或36±1恒溫箱,若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?/span>48~50水浴放置2h后判定結(jié)果者。
2)barritt氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°cα萘酚(2-na-phthol)純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶0.2ml,搖動(dòng)2~5min,陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色,若無紅色出現(xiàn),靜置于室溫或36±1恒溫箱,如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。
3)快速法:將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán),乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動(dòng)后放置5min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。
本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí),通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生,故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。


4、甲基紅(methyl red)試驗(yàn)
腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸,進(jìn)一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產(chǎn)生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。
試驗(yàn)方法:挑取新的待試純培養(yǎng)物少許,接種于通用培養(yǎng)基,培養(yǎng)于36±130(以30較好)3~5天,從第二天起,每日取培養(yǎng)液1ml,加甲基紅指示劑1~2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色,陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5仍為陰性、即可判定結(jié)果。
甲基紅為酸性指示劑,ph范圍為4.4~6.0,其pk值為5.0。故在ph5.0以下,隨酸度而增強(qiáng)黃色,在ph5.0以上,則隨堿度而增強(qiáng)黃色,在ph5.0或上下接近時(shí),可能變色不夠明顯,此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,重復(fù)試驗(yàn)。


5、靛基質(zhì)(imdole)試驗(yàn)
某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。
試驗(yàn)方法:將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管,于36±1培養(yǎng)24h時(shí)后,取約2ml培養(yǎng)液,加入kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁徐緩加入kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈紅色,即為陽性。
實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng),若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取,再加試劑,則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色,因而結(jié)果更為可靠。


6、硝酸鹽(nitrate)還原試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾。?/span>硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。
試驗(yàn)方法:臨試前將試劑的a(磺胺酸冰醋酸溶液)和bα-萘胺乙醇溶液)試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面,立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性,若無紅色出現(xiàn)則為陰性。α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。


7、明膠(gelatin)液化試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽,又進(jìn)一步水解為氨基酸,失去凝膠性質(zhì)而液化。
試驗(yàn)方法:挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果,若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化,如確被液化,即為試驗(yàn)陽性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10~20min后,菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。


8、尿素酶(urease)試驗(yàn)
有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶,將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶,因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖冢?xì)菌均能合成此酶。其活性最適ph7.0。
試驗(yàn)方法:挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中,搖均,于36±1℃培養(yǎng)10,60120min,分別觀察結(jié)果;蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面,不要到達(dá)底部,留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2424h分別觀察結(jié)果,如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天,作最終判定,變?yōu)榉奂t色為陽性。


9、氧化酶(oxidase)試驗(yàn)
氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶,為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶,氧化酶先使細(xì)胞色素c氧化,然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對(duì)苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)。
試驗(yàn)方法:在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,陽性者kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。


10、硫化氫(H2S)試驗(yàn)
有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產(chǎn)生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。
試驗(yàn)方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中,沿管壁穿刺接種,于36±1℃培養(yǎng)24~28h,培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空,以不會(huì)被濺濕為適度;用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽性。


11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物,穿刺接種并涂布于斜面,36±1℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。
本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣(變黃);產(chǎn)生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態(tài)下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。


12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力(sim)瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法:以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度,置36±1℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長(zhǎng)為有動(dòng)力,然后加kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部,可作為對(duì)照。
本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。

三、血清學(xué)試驗(yàn)
血清學(xué)反應(yīng)是指:相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用,可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中,常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌,以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。


血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn):
1)
抗原體的結(jié)合具有特異性,當(dāng)有共同抗原體存在時(shí),會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
2)
抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合,這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定,但是可逆的。
3)
抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的,只有比例適當(dāng)時(shí),才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。
4)
血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行,但其間無嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段,反應(yīng)速度很快,只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢,但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段,表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢,需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。而且,在第二階段反應(yīng)中,電解質(zhì)、ph、溫度等環(huán)境因素的變化,都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。
習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別:凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。


1、凝集反應(yīng)
顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合,在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象,稱為凝集反應(yīng)(agglutination reaction)。其中的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中,因?yàn)閱挝惑w積抗體量大,做定量實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)稀釋抗體。
1)直接凝集反應(yīng)
顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng),稱為直接凝集反應(yīng)(direct agglution reaction)。
a.
玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來檢測(cè)未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴,在玻片上混勻,數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊,即陽性反應(yīng),證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡(jiǎn)便,但不能進(jìn)行定量測(cè)定。
b.
試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來檢測(cè)血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y(cè)定抗體的含量,故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小時(shí)觀察,血清最高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的,為該抗血清的凝集效價(jià)。


2)間接凝集反應(yīng)
將可溶性抗原(抗體)先吸附在一種與免疫無關(guān)的,顆粒狀微球表面,然后與相應(yīng)抗體(抗原)作用,在有電解質(zhì)存在的條件下,即可發(fā)生凝集,稱為間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng),敏感性很高。


2、沉淀反應(yīng)
可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合,在有適量電解質(zhì)存在下,經(jīng)過一定時(shí)間,形成肉眼可見的沉淀物,稱為沉淀反應(yīng)(precipitation)。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原,抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大,為了不使抗原過剩,故應(yīng)稀釋抗原,并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。
1)環(huán)狀沉淀反應(yīng):是一種定性試驗(yàn)方法,可用已知抗體檢測(cè)未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原與抗體對(duì)應(yīng),則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。


2)絮狀沉淀反應(yīng):將已知抗原與抗體在試管(如凹玻片)內(nèi)混勻,如抗原抗體對(duì)應(yīng),而又二者比例適當(dāng)時(shí),會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀,此為陽性反應(yīng)。


3)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn):利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散,若抗原抗體對(duì)應(yīng),且二者比例合適,在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。每對(duì)抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對(duì)抗原抗體,就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)?捎糜诿庖叩鞍含量的測(cè)定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。由于方法簡(jiǎn)便易行,常用于測(cè)定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。


3、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)
補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(complement fixation reaction)是在補(bǔ)體參與下,以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性,能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合,就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合,就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此,整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)(已知抗體或抗原、未知抗原或抗體)及指示系統(tǒng)(綿羊細(xì)胞和溶血素)五種成份參加。
其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌,是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果,說明抗原抗體是相對(duì)應(yīng)的,如果出現(xiàn)溶血,說明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜,敏感性高,特異性強(qiáng),能測(cè)出少量抗原和抗體,所以應(yīng)用范圍較廣。


編輯:songjiajie2010

 
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