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細(xì)菌鞭毛染色的方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2011-01-13  來(lái)源:互聯(lián)網(wǎng)
核心提示:介紹了細(xì)菌鞭毛染色的幾種方法以及個(gè)人的實(shí)驗(yàn)心的

目前,細(xì)菌鞭毛染色方法根據(jù)染色劑的不同,可分為堿性復(fù)紅法、副品紅法、結(jié)晶紫法、維多利亞藍(lán)B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類,前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸,染色原理通常是采用不穩(wěn)定的膠體溶液做媒染劑,并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛腫脹(tar and feather)”,鞭毛直徑加粗,進(jìn)一步染色后即可在油鏡下觀察。

1. 堿性復(fù)紅法和副品紅法
1926年由Gray首創(chuàng),其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml,硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml,飽和氯化汞水溶液2ml,3%堿性復(fù)紅乙醇(95%)溶液0.4ml,臨用前混合,且需過(guò)濾后方可使用。染片時(shí),媒染劑染色約6min,具體時(shí)間尚需在試驗(yàn)中摸索確定,染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復(fù)紅染液,染片時(shí)需要1小片吸水紙蓋在涂片上,染色3min。由于該方法媒染劑混合物不穩(wěn)定、操作復(fù)雜、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)。Leifson于1930年建立了副品紅法,并于1938年和1951年兩次對(duì)該方法進(jìn)行了改良,稱為L(zhǎng)eifson方法。染色試劑由3種溶液組成:A為1.5%NaCl水溶液,B為3%單寧酸水溶液,C為乙酸副品紅0.9g,堿性副品紅0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用時(shí)把等體積A和B混合,然后再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1~2個(gè)月。
 

2. 結(jié)晶紫法,又稱Ryu法
1937年由Ryu建立,1982年由Kodaka等進(jìn)行了改良。媒染劑:5%石碳酸10 ml,2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑:飽和結(jié)晶紫乙醇溶液,即12g結(jié)晶紫溶于100 ml無(wú)水乙醇中。使用時(shí)把10份媒染劑與1份染色劑混合,染色5min。1989年,Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑,采用濕片技術(shù)進(jìn)行鞭毛染色,雖然可以觀察到細(xì)菌鞭毛,但效果不好。Ryu染色方法優(yōu)點(diǎn)是試劑比較穩(wěn)定,目前Difco公司已經(jīng)研制出該方法的商品試劑盒,但染色效果亦不甚理想.

3. 維多利亞藍(lán)B法
1990年由Inoue等報(bào)道日本制藥株式會(huì)社Shionogi Seiyaku研制出一種細(xì)菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍(lán)B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁,染色約需7min。該試劑保存期約為6個(gè)月,關(guān)于其染色效果雖然有過(guò)一篇文獻(xiàn)評(píng)述,但卻沒(méi)有采用評(píng)分法進(jìn)行評(píng)價(jià),很難判斷其染色效果。

4. 鍍銀染色法
1958年Rhodes根據(jù)Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法,建立了一種細(xì)菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液:10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液,再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉淀,通過(guò)搖動(dòng)又能重新溶解,加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液,穩(wěn)定10 min后使用。銀染液:配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用,再緩慢加入濃氨水(比重0.880)使形成的沉淀剛好重新溶解,最后把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入,直到搖動(dòng)后呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀溶液為止,避光保存,可穩(wěn)定數(shù)周。用媒染液染片3~5min,蒸餾水充分洗滌后,再把銀染液滴加至涂片上。加熱至接近沸騰,染色3~5min。
由于Rhodes鍍銀染色法媒染液成分復(fù)雜、操作繁鎖,所以1965年Blenden等改良了細(xì)菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A:100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸,1.5 gFeCl3,15%福爾馬林2 ml,1%NaOH溶液1 ml。試劑B:使用2% AgNo3,其他同于Rhodes,但試劑不穩(wěn)定,要求在4h內(nèi)使用,并用要用氨水調(diào)pH至10。試劑A染片2~4min,試劑B染色30 s,不需加熱。
由于以上兩種鍍銀染色方法都要使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,并且需用無(wú)菌蒸餾水懸浮菌液制片,未采用評(píng)分法評(píng)價(jià)鍍銀染色方法。因此1977年,West等對(duì)鍍銀染色法進(jìn)一步改良,制備涂片時(shí)直接使用血平板,評(píng)價(jià)染色效果首次使用5分制,通過(guò)該評(píng)價(jià)方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方:媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml,10%單寧酸50 ml,5%FeCl3水溶液5 ml,5℃保存,染色液配制同Rhodes,但需避光5℃保存。媒染液染片4min,銀染液滴加至涂片上加熱至微冒蒸汽,染色4min。同時(shí)West等還對(duì)使用不同培養(yǎng)基進(jìn)行染色效果評(píng)價(jià),包括半固體動(dòng)力培養(yǎng)基、血瓊脂平板、TSA(trypticase soy agar)斜面,其中半固體動(dòng)力培養(yǎng)基和TSA斜面25℃,培養(yǎng)18~24h;血瓊脂平板35~37℃,培養(yǎng)18~24h。評(píng)價(jià)結(jié)果血瓊脂平板35~37℃,培養(yǎng)18~24h不適于細(xì)菌鞭毛染色,而半固體動(dòng)力培養(yǎng)基和TSA斜面25℃,培養(yǎng)18~24h適合于細(xì)菌鞭毛染色,同時(shí)也證明了使用福爾馬林處理標(biāo)本制備涂片并不能有效阻止鞭毛脫落。
由于鍍銀染色法媒染液不穩(wěn)定,需避光5℃保存,1992年P(guān)orter等繼續(xù)改良該方法,其試劑配方同West等的方法,只是媒染劑避光室溫可保存數(shù)月,延長(zhǎng)媒染劑染色時(shí)間為8 min,染色液不需加熱,只染30 s,制備涂片程序略有不同。使用TSA平板,36℃培養(yǎng)24h,但遺憾的是Porter等只使用了1種細(xì)菌(奇異變形桿菌)進(jìn)行研究。
于是1994年Finegan等進(jìn)一步證實(shí)使用過(guò)期媒染劑進(jìn)行鍍銀染色可以增強(qiáng)鞭毛染色效果,并使用4種細(xì)菌(綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、枯草芽孢桿菌),用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板,26℃培養(yǎng)24h。試劑配方仍不變,媒染液放置1、2、4、8、16周后進(jìn)行染色,媒染液染色8 min,銀染液染色30~60 s,不需加熱。這4種細(xì)菌均染色成功,從而證明媒染液可至少放置16周。

5、鞭毛的負(fù)染
具體操作:菌懸液,直接滴在銅網(wǎng)上,1-2分鐘后,吸去多余的菌液(似干非干的程度),再滴上0.1%的磷鎢酸溶液,1分鐘后,吸去多余的染液,然后就可以在電鏡下觀察了。一般染色后十五天之內(nèi)看電鏡。時(shí)間太長(zhǎng)效果不好。這是我試驗(yàn)用的方法。

 曾做過(guò)一段時(shí)間的細(xì)菌鑒定,以下是一些染色心得:
首先染色用玻片一定要干凈,洗液泡過(guò)之后蒸餾水沖洗干凈。涂片的時(shí)候菌千萬(wàn)別涂得太多。第一部染色時(shí),可將玻片置于水浴鍋內(nèi),溫度保持在35度,蓋上蓋(主要是保持一定的濕度,防止染色液變干不利于沖洗,這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液沖洗干凈,否則影響染色效果,背景可能非常 臟。其他的步驟參考書(shū)上的資料進(jìn)行,一般沒(méi)什么問(wèn)題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌,效果非常好。

注意事項(xiàng):
1. 要注意培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間:①用點(diǎn)接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個(gè)平板點(diǎn)接3~4處。經(jīng)比較用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的菌體活動(dòng)度大,鞭毛長(zhǎng)且多,易于染色,這可能與半固體培養(yǎng)基更適于菌體運(yùn)動(dòng)、鞭毛生長(zhǎng)較好有關(guān)。用點(diǎn)接種法在平板上接種更易于挑取邊緣幼齡的菌體。②培養(yǎng)時(shí)間要嚴(yán)格掌握,一般培養(yǎng)9~12h較好,菌齡超過(guò)15h,鞭毛染色效果較差,這可能與老齡菌體活動(dòng)度降低、鞭毛易脫落有關(guān)。

2.染色過(guò)程中的細(xì)節(jié)也應(yīng)充分注意:①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。②取菌后的接種環(huán)在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可,不要用力太猛,更不能用接種環(huán)大幅度涂開(kāi);將載片稍傾斜,使菌液散開(kāi)即可,否則鞭毛易脫落,造成染色失敗。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥,不能用熱風(fēng)吹干,不能熱固定,這是由于加熱后菌體易變形,鞭毛易脫落,影響觀察。④A染液染3~5 min,其后用蒸餾水(自來(lái)水效果差)沖洗時(shí)一定要充分,否則加B染液后,背景很臟,鞭毛不易被觀察到,影響實(shí)驗(yàn)效果。⑤加B染液后,將玻片稍加熱(但不能太熱,更不能沸騰或蒸干)使其微冒蒸汽,30~60 s,染色效果較不加熱為好。⑥B染液染完后,用蒸餾水沖洗比用自來(lái)水沖洗效果好。
 

編輯:songjiajie2010

 
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