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細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-09-01
核心提示:(一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法。(二)實(shí)驗(yàn)原理:用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染

(一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>學(xué)習(xí)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法。

(二)實(shí)驗(yàn)原理:用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷,能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低,當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷,所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷,能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí),細(xì)菌所帶正電荷增加,因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料,如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。

簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài),簡(jiǎn)單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類,是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。

該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G,是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì),而且聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性,使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)菌就被脫色,再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。

(三)實(shí)驗(yàn)器材

1、活材料:培養(yǎng)12-16h的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)或者枯草桿菌(Bacillus subtilis),培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌Escherichia coli

2、染色液和試劑:結(jié)晶紫附二、、3、盧哥氏碘液(附二、、4、95%酒精、附二、、5、復(fù)紅附二、2、二甲苯、香柏油

3、器材:廢液缸、洗瓶、載片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

(四)實(shí)驗(yàn)方法:

1、簡(jiǎn)單染色:

1)涂片:取干凈載片一塊,在載片的左、右各加一滴蒸餾水,按無(wú)菌操作法取菌涂片,左邊涂蘇云金桿菌,右邊涂大腸桿菌,做成濃菌液。再取干凈載片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面,將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載上制薄的涂面,注意取菌不要太多。

2)晾干:讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。

3)固定:手執(zhí)片一端,讓菌膜朝上,通過(guò)火焰2-3次固定(以不燙手為宜)

4)染色:將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上,加復(fù)紅染色1-2min。

5)水洗:用水洗去涂片上的染色液

6)干燥:將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。

7)鏡檢:先低觀察,再高倍觀察,并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出,在涂片上加香柏油一滴,將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。

2、革蘭氏染色:

1)涂片:涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片相同。

2)晾干:與簡(jiǎn)單染色法相同。

3)固定,與簡(jiǎn)單染色法相同

4)結(jié)晶紫色染色:將片置于廢液缸片擱架上,加適量(以蓋滿細(xì)菌涂面)的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。

5)水洗:傾去染色液,用水小心地沖洗。

6)媒染滴加盧哥氏碘液,媒染1min。

7)水洗:用水洗去碘液。

8)脫色:將片傾斜,連續(xù)滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無(wú)色,立即水洗。

9)復(fù)染:滴加蕃紅復(fù)染5min。

10)水洗:用水洗去涂片上的紅染色液。

11)晾干:將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

12)鏡檢:鏡檢時(shí)先用低,再用高倍,最后用油鏡觀察,并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。

13)實(shí)驗(yàn)完畢后的處理:

將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈,a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。

②看后的染色片用廢紙將香柏油擦干凈。

(五)實(shí)驗(yàn)作業(yè)

給出Bacillus thuringiensisEscherichia coli的形態(tài)圖,并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。

(六)注意事項(xiàng)

1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過(guò)度,革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌;如脫色時(shí)間過(guò)短,革蘭氏陰性也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,難以嚴(yán)格規(guī)定。

2.染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后,應(yīng)吸去玻片上的殘水,以免染色液被稀釋而影響染色效果。

3.選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h,E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老,由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。

編輯:foodadmin

 
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