顯微技術是微生物檢驗技術中最常用的技術之一。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗中最常用的還是普通光學顯微鏡。　　

一、普通光學顯微鏡的結構和基本原理：

1.結構：

　　光學顯微鏡是由光學放大系統(tǒng)和機械裝置兩部分組成。光學系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉換器、鏡臺、鏡臂和底座等。（圖３－１）

　　標本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離很短，使用時需格外注意。目鏡只起放大作用，不能提高分辨率，標準目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線照射標本后進入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱，因而對提高物鏡分辨率是很重要的。聚光鏡可以上下移動，以調節(jié)光的明暗，可變光闌可以調節(jié)入射光束的大小。

　　顯微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和強度都容易控制。一般的顯微鏡可用普通的燈光，質量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發(fā)揮其性能。有些需要很強照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素燈作為光源。

　圖３－１　光學顯微鏡結構圖

2.原理：

　　顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑決定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質折射率，當空氣為介質時折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。

二、普通顯微鏡的使用方法

1、低倍鏡觀察

　　先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標本片，轉動反光鏡，調好光線，將物鏡提高，向下調至看到標本，再用細調對準焦距進行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應調到適當?shù)拇笮�，以控制射入光線的量，增加明暗差。

2、高倍鏡觀察

　　顯微鏡的設計一般是共焦點的。低倍鏡對準焦點后，轉換到高倍鏡基本上也對準焦點，只要稍微轉動微調即可。有些簡易的顯微鏡不是共焦點，或者是由于物鏡的更換而達不到共焦點，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調準焦點的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動聚光鏡，觀察圖像是否清晰。

3、油浸鏡觀察

　　油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時，一般是經低倍、高倍到油浸鏡。當高倍物鏡對準標本后，再加油浸鏡觀察。載玻片標本也可以不經過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調向上調準焦點。沒有自動止降裝置的，對準焦點的方法是從顯微鏡的側面觀察，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調向上提升調準焦點。

　　使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調節(jié)的顯微鏡燈作光源。

三、普通顯微鏡的保養(yǎng)

　　顯微鏡是精密貴重的儀器，必須很好地保養(yǎng)。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中，同時要注意下列事項：

1、觀察完后，移去觀察的載玻片標本。

2、用過油浸鏡的，應先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。

3、轉動物鏡轉換器，放在低倍鏡的位置。

4、將鏡身下降到最低位置，調節(jié)好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套。

　　鏡頭的保護最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要時可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團蘸取少量的二甲苯，輕擦，并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。目鏡是否清潔可以在顯微鏡下檢視。轉動目鏡，如果視野中可以看到污點隨著轉動，則說明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過后用洗耳球將短絨吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時，都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好，以防灰塵進入鏡筒內，落在鏡筒下面的物鏡上。

四、顯微計數(shù)

　　利用血球計數(shù)器在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常見的微生物計總數(shù)的方法。因為計數(shù)器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算單位體積內微生物總數(shù)。

　　血球計數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個方格網，每一方格網共分九個大方格，其中間的一個大方格用來做微生物計數(shù)，所以又稱為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種，一種是每個大方格分成16個中方格，每中方格又分成25個小方格。另一種是一個大方格分25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（25×16或16×25）400個小方格。（圖３－２）因為每個大方格邊長為1毫米，載片與蓋片間距離為0.1毫米，所以每個計數(shù)室（1個大方格）體積為0.1

　圖３－２　兩種血球計數(shù)板

a. 25X16計數(shù)板 b.16X25計數(shù)板

立方毫米。測出每個中方格菌數(shù)，就可以算出一個大方格的菌數(shù)，由此推算出1毫升菌液內所含的菌數(shù)。

　　一個大方格是16個中方格時，應當數(shù)4角4個中方格（即100個小方格）的菌數(shù)，一個大方格是25個中方格時，除取4角4個中方格外，還要數(shù)中央一個中方格（即為80個小方格）的菌數(shù)。

計算公式如下：

16×25計數(shù)板：

總菌數(shù)/ml=×400×10000×稀釋倍數(shù)

=每個小方格內菌數(shù)×4×10⁶×稀釋倍數(shù)

25×16計數(shù)板：

總菌數(shù)/ml=×400×10000×稀釋倍數(shù)

=每小方格內菌數(shù)×4×10⁶×稀釋倍數(shù)