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菌落總數(shù)檢測(cè)的注意事項(xiàng)與快速檢測(cè)技術(shù)!

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-05-09
核心提示:引言食品安全事件的頻頻發(fā)生,使得民眾對(duì)食品安全問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注。為了確保食品安全,政府部門(mén)除了要出臺(tái)相關(guān)法律法規(guī)外,更為重
 

引言

 

食品安全事件的頻頻發(fā)生,使得民眾對(duì)食品安全問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注。為了確保食品安全,政府部門(mén)除了要出臺(tái)相關(guān)法律法規(guī)外,更為重要的是要建立起更為科學(xué)的食品安全性的檢測(cè)技術(shù)。規(guī)范的檢測(cè)方法是有效保障食品安全的重要環(huán)節(jié),它要求檢驗(yàn)數(shù)據(jù)具有更高的準(zhǔn)確度和可信度。食品中菌落總數(shù)反映了食品在生產(chǎn)過(guò)程中的衛(wèi)生情況,體現(xiàn)食品被細(xì)菌污染的程度,是做出科學(xué)衛(wèi)生評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。本文主要對(duì)國(guó)標(biāo)法微生物檢測(cè)中菌落總數(shù)測(cè)定采用的傳統(tǒng)方法即平板計(jì)數(shù)法的注意事項(xiàng)進(jìn)行相關(guān)的分析,并著重介紹了快速檢測(cè)技術(shù)在菌落總數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。

一、 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

1.傳統(tǒng)檢測(cè)方法的流程圖[2]

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2.注意事項(xiàng)

國(guó)標(biāo)法測(cè)菌群總數(shù)是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合后,每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個(gè)可見(jiàn)的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20%),因而并不能測(cè)出每g或mL檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù),厭氧菌、微嗜氧菌和冷營(yíng)菌在此條件下不生長(zhǎng),有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制,因此所得結(jié)果,只包括一群能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。國(guó)標(biāo)法檢測(cè)應(yīng)注意以下問(wèn)題:

2.1 所用器皿及稀釋液

2.1.1 檢驗(yàn)中所用玻璃器皿,如培養(yǎng)皿,吸管、試管等必須是完全滅菌的,并在滅菌前徹底洗滌干凈,不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2.1.2 用作樣品稀釋的液體,每批都要有空白對(duì)照。如果在瓊脂對(duì)照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí),要追加對(duì)照平板,以判定是空白稀釋液,用于傾注平皿的培養(yǎng)基,還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
2.1.3 檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水,但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1%蛋白胨水為合適,因蛋白胨水對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用,不會(huì)因?yàn)樵谙♂屵^(guò)程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對(duì)含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋?zhuān)瑒t需采用蒸餾水。

 

2.2 樣品稀釋

2.2.1 檢樣稀釋時(shí),無(wú)菌稱(chēng)取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225mL滅菌稀釋液的玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠),經(jīng)充分振搖作成1:10的稀釋液。制備10倍系列稀釋的樣品勻液時(shí),每一步都應(yīng)該搖勻試管或反復(fù)吹吸,使菌體能夠盡量分散均勻。如系肉、魚(yú)等固體樣品,最好剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻,或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中,以8000-10000rpm速度攪拌1分鐘,使做成均勻的1:10稀釋液。對(duì)于像食醋或酸性飲料等酸度較高的樣品,如果直接用原樣液來(lái)檢測(cè)菌落總數(shù),結(jié)果會(huì)偏低甚至為0 ,只有嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌的20-30%碳酸鈉溶液將其PH值調(diào)至中性后方可準(zhǔn)確檢測(cè)出菌落總數(shù)。

2.2.2 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì),將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個(gè)適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成1:100的稀釋液,然后依次遞增稀釋?zhuān)龀?:1 000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次,必須另?yè)Q1支1mL滅菌吸管,這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
2.2.3 從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時(shí),不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分;而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時(shí),也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分;因?yàn)檫@些部分都可能接觸過(guò)手或其他沾污物。
2.2.4 在作10倍遞增稀釋中,吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm;吸入液體時(shí),應(yīng)先高于吸管刻度,然后提起吸管尖端離開(kāi)液面,將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度,這樣取樣較準(zhǔn)確,而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時(shí)不會(huì)有多余的液體粘附于管外。   

2.2.5 當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時(shí),應(yīng)小心沿管壁加入,不要觸及管內(nèi)稀釋液,以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。

 

2.3 平板接種與培養(yǎng)

2.3.1 將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時(shí),應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì),選擇2—3個(gè)適宜稀釋度,分別在作1O倍遞增稀釋的同時(shí),即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入,不要揭去皿蓋),最后將吸管直立使液體流畢,并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出,而不要吹出。每個(gè)稀釋度應(yīng)作2個(gè)平皿。

2.3.2 培養(yǎng)溫度,應(yīng)根據(jù)食品種類(lèi)而定。肉、乳、蛋類(lèi)食品用37℃培養(yǎng),水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為48±2h。其他食品,如清涼飲料,調(diào)味品,糖果、糕點(diǎn).果脯,酒類(lèi)(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用37℃24±2h培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時(shí)間之所以有這種不同的區(qū)分,是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時(shí),分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時(shí)間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來(lái)自淡水或海水,水底溫度較低,因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí),系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。

 

2.4 菌落計(jì)數(shù)

2.4.1 在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí),有一些樣品的殘?jiān)鼤?huì)在視覺(jué)上與菌落混淆,因此,在進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)該仔細(xì)分辨。菌落的形狀相對(duì)規(guī)則,比較有光澤度,更飽滿,而樣品的殘?jiān)容^不規(guī)則,沒(méi)有菌落的飽滿度和光澤度。另外,還可向培養(yǎng)基中添加一定濃度的TTC,可以使菌落成紅色,便于觀測(cè)和計(jì)數(shù),但TTC的濃度不宜過(guò)高,否則會(huì)抑制菌落的生長(zhǎng)。

2.4.2 從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí),應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個(gè)平皿和不同稀釋度的幾個(gè)平皿內(nèi)平板上菌落生長(zhǎng)情況。平行試驗(yàn)的2個(gè)平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近,不同稀釋度的幾個(gè)平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比,即檢樣稀釋倍數(shù)越大,菌落數(shù)越低,稀釋倍數(shù)越小,菌落數(shù)越高。
2.4.3 菌落計(jì)數(shù)所得結(jié)果,可分別按以下幾種不同情況作報(bào)告。

2.4.3.1 若1個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30—300之間,則將該菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之。

2.4.3.2 若有兩個(gè)稀釋度,其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30—300之間,則視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)。
2.4.3.3 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。

2.4.3.4 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。

二、快速檢測(cè)新技術(shù)

 

1.3M測(cè)試片快速分析技術(shù)

1.1 3M測(cè)試片快速分析技術(shù)概念

3M測(cè)試片法是一種便捷可再生水化干膜,適用于細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。

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1.2 檢測(cè)步驟

只需三步就可實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的測(cè)定。(以大腸桿菌的為例)

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1.3 結(jié)果判讀

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①測(cè)試片中含有一種紅色指示染劑可使菌落著色,計(jì)算所有紅色菌落(不論其大小和顏色深淺均計(jì)算之)。

②測(cè)試片上沒(méi)有任何菌落生長(zhǎng)。

③有不多的菌落。

④測(cè)試片菌落數(shù)適宜計(jì)數(shù)范圍是25-250。

⑤測(cè)試片面積約為20平方厘米,當(dāng)菌落數(shù)超過(guò)250個(gè),如5所示,為了估計(jì)菌落數(shù),可選擇其中一個(gè)或數(shù)個(gè)有代表性菌落的小方格(1cm2),計(jì)算平均菌落數(shù),再乘以20可得到整個(gè)測(cè)試片上的菌落數(shù)。

⑥ 測(cè)試片上菌落太多而無(wú)法計(jì)數(shù)。

⑦有很多高數(shù)量菌落,使整個(gè)生長(zhǎng)區(qū)變粉色,應(yīng)計(jì)錄為菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)。

⑧有時(shí)菌落分布出現(xiàn)不均衡,如8所示,這也記錄為菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)。

⑨測(cè)試片上的菌落,最先粗略一看是可計(jì)數(shù)的,然而,你密切注意到生長(zhǎng)區(qū)邊緣,能看到高密度的菌落,應(yīng)記錄為菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)。

 

1.4 測(cè)試片法特點(diǎn)

1.4.1 工作效率的極大提高

根據(jù)大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),使用 3M測(cè)試片技術(shù), 可以提高實(shí)驗(yàn)室工作效率 118% 以上。勞動(dòng)資源的最佳使用帶來(lái)生產(chǎn)能力的提高,最終的效果就是效益的增加。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法

品質(zhì)穩(wěn)定的快速測(cè)試片克服了傳統(tǒng)的測(cè)試方法存在的由于使用不同批次的培養(yǎng)基,不同的配制條件,不同配制人員而導(dǎo)致的差異性。

1.4.3 國(guó)際化的認(rèn)證方法

3M快速測(cè)試的方法得到包括 AOAC,AFNOR 在內(nèi)的國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證,在全球許多國(guó)家也已獲得官方機(jī)構(gòu)的正式批準(zhǔn),從而可以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和在世界各地的廣泛認(rèn)可。

1.4.4 快速得到檢測(cè)結(jié)果

對(duì)比傳統(tǒng)的測(cè)試方法, 3M快速測(cè)試片縮短檢測(cè)時(shí)間,使您在更短的時(shí)間內(nèi)獲得樣品的測(cè)試結(jié)果,能更加迅速地采取有效的措施解決發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題。

1.4.5 方便進(jìn)行HACCP 認(rèn)證

由于檢測(cè)速度快,檢測(cè)項(xiàng)目全,準(zhǔn)確性高。3M為食品生產(chǎn)工藝過(guò)程中關(guān)鍵控制點(diǎn)的監(jiān)控提供了較為完整的系列產(chǎn)品,可以對(duì)包括生產(chǎn)線,生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境在內(nèi)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行全面的測(cè)試。

2.ATP法

2.1 ATP熒光法檢測(cè)總菌落數(shù)原理

螢火蟲(chóng)會(huì)發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎獰晒馑孛浮⑾x(chóng)熒光素(D-luciferin)以及所有細(xì)胞生物都產(chǎn)生的生物能量物質(zhì)—三磷酸腺苷(ATP)。在有氧的條件下,蟲(chóng)光素酶催化蟲(chóng)熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng),形成氧化熒光素并發(fā)出熒光,其生化反應(yīng)式如下:

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2.2 ATP法特點(diǎn):

2.2.1 具有成本低,操作簡(jiǎn)單,響應(yīng)速度快等特點(diǎn),

2.2.2 微生物 ATP 生物發(fā)光法在國(guó)外已被廣泛地運(yùn)用于食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。

3.MTT法

3.1 MTT法檢測(cè)原理

檢測(cè)原理為活體微生物線粒體中含有琥珀酸脫氫酶,能使外源性MTT(噻唑藍(lán))還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。Formazan結(jié)晶形成的量與活菌數(shù)成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活菌細(xì)胞數(shù)量。

3.2 應(yīng)用實(shí)例:巴氏消毒奶中活菌素快速檢測(cè)

取巴斯消毒奶10mL ,至于無(wú)菌離心管中3000rpm離心5分鐘,棄去上清。加入10mL無(wú)菌生理鹽水洗滌離心管,再次3000rpm離心5分鐘,棄去上清取出奶液基質(zhì)。加入1mL生理鹽水重懸底部的微生物,取0.2mL到96孔酶標(biāo)板中,同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)菌液做標(biāo)準(zhǔn)曲線,統(tǒng)一加入底物反應(yīng)30分鐘,讀數(shù)。

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3.3 該方法的特點(diǎn):檢測(cè)快速,靈敏度高。

4.流式細(xì)胞術(shù)

4.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原理

檢測(cè)原理:細(xì)胞經(jīng)特異熒光素標(biāo)記后,通過(guò)激光照射,產(chǎn)生特異熒光信號(hào),通過(guò)對(duì)這些熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量計(jì)算出菌群總數(shù)。

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4.2 特點(diǎn):快速、便捷結(jié)果可靠、便于操作。


結(jié)語(yǔ):

菌落總數(shù)是微生物檢測(cè)中最常見(jiàn)的項(xiàng)目,在檢驗(yàn)的每一個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)該小心謹(jǐn)慎,精準(zhǔn)操作,確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。國(guó)標(biāo)法采用的平板計(jì)數(shù)法是我們最常用的檢測(cè)方法,但是操作過(guò)程較為復(fù)雜,時(shí)間較長(zhǎng);而其他方法操作簡(jiǎn)便,省時(shí),但是有的成本相對(duì)較高,并且有的只針對(duì)特定的食品種類(lèi)。我們應(yīng)該積極關(guān)注新的科學(xué)技術(shù)在檢測(cè)方法中的應(yīng)用,讓檢測(cè)更加精確、經(jīng)濟(jì)、便捷和可靠。

編輯:songjiajie2010

 
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