革蘭氏染色是細(xì)菌鑒別染色方法中最常使用的,染色結(jié)果可區(qū)分革蘭氏陽性菌及陰性菌,是鑒定細(xì)菌最重要的分類依據(jù)之一。
初染劑:結(jié)晶紫,步驟中最先使用的試劑,把細(xì)菌染成藍(lán)紫色。
媒染劑:革蘭氏碘液,可與初染劑結(jié)合,形成結(jié)晶紫及碘復(fù)合物(CV-I),加強染料顏色的固定。
脫色劑:95%乙醇,因陽性菌與陰性菌細(xì)胞壁構(gòu)造不同,而有不同的脫色反應(yīng)。
復(fù)染劑:番紅,被上述步驟脫色的細(xì)菌,就會被這此試劑染成紅色。
革蘭氏染色法是由丹麥微生物學(xué)家漢斯-克理斯蒂安-革蘭(Hans Christian Gram)于1884年發(fā)明,至今仍為鑒別細(xì)菌之最重要方法。依據(jù)革蘭氏染色法可將細(xì)菌分為革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性兩類。其染色原理推測與此兩類細(xì)菌之細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有重大關(guān)系。
其一為:革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁含脂量高,酒精脫色時會將部份脂質(zhì)萃取出來,而使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松動,通透性增加,故結(jié)晶紫-碘復(fù)合體(CV-I)被帶出細(xì)菌體外而無色。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁幾乎不含脂質(zhì),酒精甚至?xí)辜?xì)胞壁脫水,故結(jié)構(gòu)更加致密,結(jié)晶紫-碘復(fù)合體就被留在細(xì)菌體內(nèi)。
其二為:酒精處理時,會使細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚醣(peptidoglycan)空隙縮小。革蘭氏陽性細(xì)菌之細(xì)胞壁肽聚醣較厚,而革蘭氏陰性細(xì)菌較薄,所以造成結(jié)晶紫-碘復(fù)合體離開革蘭氏陰性細(xì)菌的機會較大。故以酒精脫色后,取用紅色的番紅進行復(fù)染,此時無色的革蘭氏陰性細(xì)菌就會變成粉紅色,而原本已染上藍(lán)色的革蘭氏陽性細(xì)菌就會變成紫色。
不論何種染色法,最基本都要先熟習(xí)抹片的制作,抹片應(yīng)厚薄適中,且宜勻而薄,細(xì)菌量不宜太多
染色時,脫色步驟可影響結(jié)果正確與否,脫色過度會使初染劑流失,使革蘭氏陽性細(xì)菌變?yōu)楦锾m氏陰性細(xì)菌的顏色:但脫色不足,則無法完全去除CV-I復(fù)合物,結(jié)果使革蘭氏陰性細(xì)菌呈現(xiàn)革蘭氏陽性細(xì)菌的顏色。此步驟非常需要經(jīng)驗的累積。
每種染劑之間,以蒸餾水或無菌水充分清洗,以除去剩余的染液。
宜使用18-24小時培養(yǎng)的新鮮菌落,因老化的細(xì)菌易失去保留初染劑的能力,而顯示出錯誤的結(jié)果,可能部分染成紅色,部分呈紫色。
建議每次染色時,可以帶品管玻片一起染色,確定染色時間及步驟正確。