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相差顯微鏡的相關(guān)知識

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-09-16
核心提示:(一)相差顯微鏡的特點(diǎn)相差顯微鏡是一種將光線通過透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)生的光程差(即相位差)轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡。光線通
 (一)相差顯微鏡的特點(diǎn) 


相差顯微鏡是一種將光線通過透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)生的光程差(即相位差)轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡。


光線通過比較透明的標(biāo)本時(shí),光的波長(顏色)和振幅(亮度)都沒有明顯的變化。因此,用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本(如活的細(xì)胞)時(shí),其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而,由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同,光線通過這種標(biāo)本時(shí),直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少,加快或落后的光波的相位會發(fā)生改變(產(chǎn)生相位差)。光的相位差人的肉眼感覺不到,但相差顯微鏡能通過其特殊裝置
——環(huán)狀光闌和相板,利用光的干涉現(xiàn)象,將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差(明暗差),從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異,對比度增強(qiáng),使我們能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。


(二)相差顯微鏡的成像原理
 
鏡檢時(shí)光源只能通過環(huán)狀光闌的透明環(huán),經(jīng)聚光器后聚成光束,這束光線通過被檢物體時(shí),因各部分的光程不同,光線發(fā)生不同程度的偏斜(衍射)。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點(diǎn)平面和相板上的共軛面重合。因此,未發(fā)生偏斜的直射光便通過共軛面,而發(fā)生偏斜的衍射光則經(jīng)補(bǔ)償面通過。由于相板上的共軛面和補(bǔ)償面的性質(zhì)不同,它們分別將通過這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱,兩組光線再經(jīng)后透鏡的會聚,又復(fù)在同一光路上行進(jìn),而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉,變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時(shí),通過無色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)化為人眼可以分辨的振幅差(明暗差)。


(三)相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和裝置 
 

相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是相同的,所不同的是它具有四部分特殊結(jié)構(gòu):即環(huán)狀光闌、相板、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡及綠色濾光片。


1、環(huán)狀光闌
 具有環(huán)形開孔的光闌。位于聚光器的前焦點(diǎn)平面上,光闌的直徑大小是與物鏡的放大倍數(shù)相匹配的,并有一個(gè)明視場光闌,與聚焦器一起組成轉(zhuǎn)盤聚光器。在使用時(shí)只要把相應(yīng)的光闌轉(zhuǎn)到光路即可。

2、相板 位于物鏡內(nèi)部的后焦平面上。相板上有兩個(gè)區(qū)域,直射光通過的部分叫“共軛面”,衍射光通過的部分叫“補(bǔ)償面”。帶有相板的物鏡叫相差物鏡,常以“Ph”字樣標(biāo)在物鏡外殼上。

相板上鍍有兩種不同的金屬膜:吸收膜和相位膜。吸收膜常為鉻、銀等金屬在真空中蒸發(fā)而鍍成的薄膜,它能把通過的光線吸收掉60%—93%,相位膜為氟化鎂等在真空中蒸發(fā)鍍成,它能把通過的光線相位推遲1/4波長。

  
根據(jù)需要,兩種膜有不同的鍍法,從而制造出不同類型的相差物鏡。如果吸收膜和相位膜都鍍在相反的共軛面上,通過共軛面的直射光不但振幅減弱,而且相位也被推遲1/4λ,衍射光因通過物體時(shí)相位也被推遲1/4λ,這樣就使得直射光與衍射光維持在同一個(gè)相位上。根據(jù)相長干涉原理,合成光等于直射光與衍射光振幅之和,因背景只有直射光的照明,所以通過被檢物體的合成光就比背景明亮。這樣的效果叫負(fù)相差,鏡檢效果是暗中之明。

  
如果吸收膜鍍在共軛面,相位膜鍍在補(bǔ)償面上,直射光僅被吸收,振幅減少,但相位未被推遲,而通過補(bǔ)償面的衍射光的相位,則被推遲了兩個(gè)1/4λ,因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根據(jù)相消干涉原理,這樣通過被檢物體的合成光要比背景暗,這種效果叫正相差,即鏡檢效果是明中之暗。

  
負(fù)相差物鏡(Negative contrast)用縮寫字母“N”表示,正相差物鏡(Positive contrast)用縮寫字母“P”表示,由于吸收膜對通過它的光線的透過率不同,可分為高、中、低及低低,如Olympus光的透過率分為:7%、15%、20%、40%四個(gè)等級,因此分為高(High略寫為H),中(Medium略寫為M),低(Low略寫為L)及低低(Low—Low略寫成LL)四類,構(gòu)成了負(fù)高(NH)、負(fù)中(NM)、正低(PL)和正低低(PLL)四種類型相差物鏡,這些字母符號都寫在相差物鏡的外殼上?筛鶕(jù)被檢物體的特性來選擇使用不同類型的相差物鏡。


3、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡
 是相差顯微鏡一個(gè)極為重要的結(jié)構(gòu)。環(huán)狀光闌的像必須與相板共軛面完全吻合,才能實(shí)現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。否則應(yīng)被吸收的直射光被泄掉,而不該吸收的衍射光反被吸收,應(yīng)推遲的相位有的不能被推遲,這樣就不能達(dá)到相差鏡檢的效果。由于環(huán)狀光闌是通過轉(zhuǎn)盤聚光器與物鏡相匹配的,因而環(huán)狀光闌與相板常不同軸。為此,相差顯微鏡配備有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡(在鏡的外殼上標(biāo)有“CT”符號),用于合軸調(diào)節(jié)。使用時(shí)撥去一側(cè)目鏡,插入合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡,旋轉(zhuǎn)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦點(diǎn),便能清楚看到一明一暗兩個(gè)圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個(gè)調(diào)節(jié)鈕,使明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與暗的相板上共軛面暗環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大,可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕,使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點(diǎn)或降到最低點(diǎn)而仍不能矯正,說明玻片太厚了,應(yīng)更換。調(diào)好后取下望遠(yuǎn)鏡,換上目鏡即可進(jìn)行鏡檢觀察。


4、綠色濾光片 
由于使用的照明光線的波長不同,常引起相位的變化,為了獲得良好的相差效果,相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光,通常是用綠色濾光片來調(diào)整光源的波長。Olympus廠家生產(chǎn)的相差顯微鏡在鏡檢時(shí)要使用該廠規(guī)定的IF550綠色濾光片作為配套器件。


(四)相差顯微鏡的使用范圍、操作步驟及注意事項(xiàng)


1、使用范圍 
相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié),適用于對活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長、運(yùn)動、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。因此,是微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必備工具。


2、操作步驟 

(1)根據(jù)觀察標(biāo)本的性質(zhì)及要求,挑選適合的相差物鏡。

(2)將標(biāo)本片放到載物臺上。

(3)進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。

(4)取下一側(cè)目鏡,換上合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡,調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合,然后取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡,換回目鏡。在使用中,如需要更換物鏡倍數(shù)時(shí),必須重新進(jìn)行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。

(5)放上綠色濾光片,即可進(jìn)行鏡檢,鏡檢操作與普通光學(xué)顯微鏡方法相同。


3、注意事項(xiàng)

(1)視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大,而且光源要強(qiáng)。因環(huán)狀光闌遮掉大部分光,物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。

(2)不同型號的光學(xué)部件不能互換使用。

(3)載玻片、蓋玻片的厚度應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn),不能過薄或過厚。

(4)切片不能太厚,一般以5—10μm為宜,否則會引起其他光學(xué)現(xiàn)象,影響成像質(zhì)量。

編輯:songjiajie2010

 
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