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神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-08-29  來源:實驗室資訊網(wǎng)
核心提示:  一、 神經(jīng)干細胞的分離無菌條件下取新生SD大鼠(出生48h內(nèi))腦組織,D-Hanks液充分漂洗后,在解剖顯微鏡下剝離腦膜,準確分離
 
 
  
一、  神經(jīng)干細胞的分離
無菌條件下取新生SD大鼠(出生48h內(nèi))腦組織,D-Hanks液充分漂洗后,在解剖顯微鏡下剝離腦膜,準確分離海馬,用眼科剪將海馬剪碎后,再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基,吸管吹打機械分離制作單細胞懸液,臺盼藍染色后細胞計數(shù),調(diào)整細胞濃度為5×104~5個/ml,置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入細胞懸液500μl。待神經(jīng)球形成后再次機械分離克隆制作單細胞懸液,仍以5×104個/ml的細胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入細胞懸液500μl。此后每7d機械分離克隆傳代1次,方法同前。
 
二、BrdU標記
將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基,過濾除菌后加入神經(jīng)球形成后再次機械分離克隆制作的單細胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L),培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球形成后,將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中,貼壁2h行BrdU免疫細胞化學(xué)染色。
 
三、  神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)分化
選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中,并加入有血清培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM/F12),一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學(xué)染色,另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培養(yǎng),觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機械分離制成單細胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細胞化學(xué)染色。
 
四、  條件培養(yǎng)液的制備
取1g雞胚的后肢骨骼肌組織,加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min,離心獲得上清液,過濾除菌后,加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。
 
五、  神經(jīng)干細胞的定向誘導(dǎo)分化
將一部分次代神經(jīng)球機械分離制成單細胞懸液后分別加入條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養(yǎng),7d后均行ChAT免疫細胞化學(xué)染色。
 
六、  免疫細胞化學(xué)染色
培養(yǎng)細胞用4%多聚甲醛固定30min后,PBS充分漂洗,然后按ABC法分別行鼠抗Nestin,鼠抗Tuj1,兔抗GFAP,鼠抗Galc,鼠抗Brdu免疫細胞化學(xué)染色,用DAB和H2O2作為呈色劑,陽性著色為棕黃色。具體方法為:
(1) 0.05M PBS漂洗 10min×3次
(2) 0.3%H2O2/0.05M PBS室溫 30min
(3) 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃,15min
(4) 0.05M PBS漂洗 10min×3次
(5) 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃,15min
(6) I抗(2%羊血清/0.05M PBS配) 4℃,48h
(7) 0.05M PBS漂洗 10min×3次
(8) II抗(2%羊血清/0.05M PBS配,1:200) 37 ℃,1.5h
(9) 0.05M PBS漂洗 10min×3次
(10) AB復(fù)合物(0.05M PBS配,1:100) 37 ℃,1.5h
(11) 0.05M PBS漂洗 10min×3次
(12) Tris-HCl緩沖液 37 ℃,15min
(13) DAB顯色 20min
(14) 蒸餾水漂洗 10min×3次
 
然后,為進一步證明實驗組的細胞是膽堿能神經(jīng)元,將已作完ChAT免疫細胞化學(xué)染色的細胞用PBS終止顯色以及進一步封閉非特異性結(jié)合位點后, 仍用ABC法行Tuj1免疫細胞化學(xué)染色,用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標陽性細胞著色為藍黑色。
 
 
編輯:songjiajie2010

 
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