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一、實驗目的
了解血球計數(shù)板的構造、計數(shù)原理和計數(shù)方法,掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能.
二、實驗原理
測定微生物細胞數(shù)量的方法很多,通常采用的有顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法.
顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液,如有雜菌或雜質,常不易分辨.菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板,一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數(shù)板.兩種計數(shù)板的原理和部件相同,只是細菌計數(shù)板較薄,可以使用油鏡觀察.而血球計數(shù)板較厚,不能使用油鏡,計數(shù)板下部的細菌不易看清.
血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片,載玻片上有4條槽而構成3個平臺.中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū),計數(shù)區(qū)的刻度有兩種:一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格(大方格用三線隔開),而每個大方格又分成25個小方格;另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格(大方格之間用雙線分開),而每個大方格又分成16個小方格.但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構造,它們都有一個共同特點,即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成.
計數(shù)區(qū)邊長為1mm,則計數(shù)區(qū)的面積為l mm2,每個小方格的面積為1/400mm2.蓋上蓋玻片后,計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm,所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000mm3.
使用血球計數(shù)板計數(shù)時,先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數(shù)量.
已知:1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以:1mm3體積應含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格,即系數(shù)K=4×106 .
因此:每ml菌懸液中含有細胞數(shù)= 每個小格中細胞平均數(shù)(N)×系數(shù)(K)×菌液稀釋倍數(shù)(d)
三、實驗器材
1. 活材料:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面或培養(yǎng)液.
2. 器材:顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片(22mm×22mm)、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙.
四、實驗方法
1. 視待測菌懸液濃度,加無菌水適當稀釋(斜面一般稀釋到10-2),以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度.
2. 取潔凈的血球計數(shù)板一塊,在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片.
3. 將酵母菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計數(shù)板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū),勿使氣泡產生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液.也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上,不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計數(shù)區(qū)深度的升高.然后加蓋蓋玻片(勿使產生氣泡).
4. 靜置片刻,將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn),先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后,再轉換高倍鏡觀察并計數(shù).由于生活細胞的折光率和水的折光率相近,觀察時應減弱光照的強度.
5. 計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成,按對角線方位,數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數(shù).如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū),除數(shù)上述四個大方格外,還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)(即80個小格).如菌體位于大方格的雙線上,計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤差.
6. 對于出芽的酵母菌,芽體達到母細胞大小一半時,即可作為兩個菌體計算.每個樣品重復計數(shù)2-3次(每次數(shù)值不應相差過大,否則應重新操作),求出每一個小格中細胞平均數(shù)(N),按公式計算出每ml(g)菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量.
7. 測數(shù)完畢,取下蓋玻片,用水將血球計數(shù)板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網(wǎng)格刻度.洗凈后自行晾干或用吹風機吹干,放入盒內保存.
五、實驗記錄
將實驗結果填入下表中:
| 計數(shù)次數(shù) | 每個大方格菌數(shù) | 稀釋位數(shù) | 試管斜面中的總菌數(shù) | 平均值 |
| 第一次 | ||||
| 第二次 |
