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腐败希瓦氏菌导致水产品腐败的原因探析

放大字体  缩小字体 发布日期：2013-08-28  来源：食品安全导刊
核心提示：从鳕鱼表皮和内脏的混合菌群中分离纯化出能够稳定代谢氧化三甲胺（TMAO）的腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）Y0612。使用非抑制性离子色谱对腐败希瓦氏菌代谢TMAO 的能力进行了分析，研究菌株对TMAO 的代谢规律。
 腐败希瓦氏菌导致水产品腐败的原因探析

摘　要：从鳕鱼表皮和内脏的混合菌群中分离纯化出能够稳定代谢氧化三甲胺（TMAO）的腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）Y0612。使用非抑制性离子色谱对腐败希瓦氏菌代谢TMAO 的能力进行了分析，研究菌株对TMAO 的代谢规律。确定Y0612 对TMAO 的还原没有受氧气的抑制，在有氧条件下比厌氧条件下对TMAO 还原效果更好；温度为15~35℃之间TMAO 的代谢率随着温度升高而略有升高。在水产品的加工中，通过SSOP 保持卫生的操作，减少与氧气的接触，对环境温度进行控制， 对于该菌均有一定的抑制作用，减少水产品的腐败。

关键词：腐败希瓦氏菌 氧化三甲胺 代谢 腐败 水产品

氧化三甲胺 (trimethylamine-N-oxide，TMAO) 分子式为 (CH3)3NO，广泛分布于海产硬骨鱼类的肌肉中[1]，是许多海洋鱼类的肌肉中非蛋白氮的重要组成部分，具有特殊的鲜味[2]。在贮藏及运输过程中，TMAO 在环境微生物和水产品自身内源性酶的作用下[3]，降解产生三甲胺（TMA），进而生成二甲胺（DMA）和甲醛（FA）等[4]。

三甲胺是海洋鱼类腐败的恶臭成分[5]，在海产鱼类加工过程中排放的高浓度废水中含量十分丰富[6~7]。三甲胺具有毒副作用，会抑制大分子（如DNA、RNA 和蛋白质）的合成，对动物胚胎具有致畸作用[8]。二甲胺具有鱼腐臭的特殊气味，是城市污水的主要臭源之一。
甲醛可与蛋白质、氨基酸结合，使蛋白质变性，使鱼肉质构变差、疏水性增加，导致鱼肉质量变差甚至变质。甲醛严重干扰人体细胞正常代谢，对细胞具有极大伤害作用，已经被世界卫生组织确定为致癌物质，能引起各种癌症，特别是白血病[9~10]。目前水产品中的甲醛问题已成为全球公共卫生关注的焦点，并被列入国家食品安全战略研究的重点。很多人认为水产品甲醛来源于外源性添加，实际上，有相当量的甲醛是水产品自身的微生物代谢产生的。在储藏过程( 包括冷藏和冷冻) 中，水产品在酶和微生物的作用下可产生甲醛。甲醛生成受到多种因素的影响，包括冷藏状态、冷藏温度、添加物质、加工工艺等[11~16]。
本文对能够稳定代谢氧化三甲胺（TMAO）的细菌Y0612 进行了研究，最终确定该菌为腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），利用非抑制性离子色谱对其代谢TMAO 的能力进行了分析，对细菌的TMAO 代谢规律进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料：新鲜太平洋真鳕，购于青岛市齐东路水产品市场。
1.1.2 试剂：氧化三甲胺(AR)，三甲胺溶液(AR)，二甲胺溶液(AR)，成都市科龙化工试剂厂；3mmol/L 甲烷磺酸溶液（GR）， 美国安捷伦公司。

1.1.3 培养基（g/L）：蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 15，FeCl3 0.01， pH7.2~7.5，121℃灭菌20min；TMAO 经0.22μm 滤膜过滤后按2.0 mg/ml 的终浓度添加。Biolog 培养基成分参照谢家仪[17]。

1.1.4 仪器：DL-CJ-2N 高性能无菌实验台，北京东联哈尔仪器制造厂；空气浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；离子色谱检测仪IC2000，美国安捷伦公司；722S 分光光度计，上海浦东物理光学仪器厂；SK-1 快速混匀器，常州精宏实验设备有限公司；LDZX-40BI 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。
1.2 稳定代谢TMAO 菌株的获取与菌种鉴定
1.2.1 菌株的获取

超净台上，取鳕鱼表皮和内脏适量，经无菌研钵研磨后， 置于含100ml 无菌生理盐水的三角瓶内，170r/min，25℃振荡培养1h。取10ml 上述菌体原液，接种到含有100ml 富集培养基的锥形瓶中，170r/min，25℃振荡培养24h。梯度稀释上述培养液，涂布平板后，在适宜条件下培养24h，依据平板的菌落数，选恰当稀释度且生长状况良好的菌为对象，进行菌种的分离。选取不同特性的菌落，进行多次反复的划线培养，直至菌种纯化。

1.2.2 菌株代谢TMAO 能力的检测
采用非抑制性离子色谱进行检测，参考郭修娟[18] 方法。
1.3 影响细菌TMAO 代谢因素的研究
1.3.1 氧气对细菌代谢TMAO 的影响

取菌株种子液5ml 接种到250ml 三角瓶中，瓶内添加100ml 含TMAO 2.0 mg/ml 的2216E 培养基，分别采用170r/ min 振荡培养和静置培养的方法分析有氧和厌氧条件下细菌的代谢能力，培养温度25℃，每隔2h 取样一次，按照1.2.2 方法进行检测；同时用分光光度计在660nm 处测吸光值，作为菌株生物量测定的参考值。

1.3.2 温度对细菌代谢TMAO 的影响

取Y0612 种子液5ml 接种到100ml 含TMAO 2.0 mg/ ml 的培养基中，分别于15℃、25℃、35℃，170r/min，振荡培养24h，每隔一定时间取样，按照1.2.2 方法进行检测；同时测定菌液660nm 的吸光值。

2 结果与分析
2.1 菌株的TMAO 代谢能力

根据菌株代谢TMAO 的离子色谱分析结果，做出发酵24h 时TMA 与TMAO 的含量变化曲线，如图1 所示。

发酵进行4h 时，非抑制型离子色谱检测到了TMA 的产生， 进行24h 时TMAO 含量已产生较大幅度的下降，降解率相当于初始含量的70%。

2.2 影响因素分析
2.2.1 氧气对细菌代谢TMAO 的影响
腐败希瓦氏菌Y0612 为兼性厌氧菌，氧气的存在能够有效促进菌株的生长。在有氧与厌氧条件下，前4h 菌株对TMAO 的代谢基本一致，10h 后，有氧条件下TMAO 代谢速率平稳上升，厌氧条件下增长缓慢（图2）。由于反应开始时，培养基中有一定量的溶解氧，一段时间后这部分氧消耗完毕，达到完全厌氧的状态。TMAO 在生长对数期被还原为TMA( 图3）。

2.2.2 温度对细菌代谢TMAO 的影响

对腐败希瓦氏菌在15℃、25℃、35℃条件下培养24h 后， 对发酵液中细菌生物量和TMAO、TMA 含量的检测结果分别如图4 和图5 所示。温度为15℃ ~35℃之间TMAO 的代谢率基本上随着温度升高而略有升高。

                                                        A

3 讨论
引起海水鱼类及制品中甲醛超标的原因除了不法分子的外源添加外，更主要的是某些海产品含有的氧化三甲胺能够在微生物和自身内源性酶的作用下产生甲醛；此外，一些加工过程如高温[19] 或添加剂[20] 等非酶途径也会导致海水鱼中甲醛含量的增高。目前，在水产品中TMAO 的代谢方面的研究侧重于内源性的氧化三甲胺酶(TMAOase) [21]，这是一类可以将TMAO 分解为DMA 和FA 的酶系统，而在关于由微生物引起的水产品腐败及其对三甲胺、二甲胺和甲醛产生所起的作用方面的研究则相对较少[22]。TMAO 还原酶（TMAO reductase）是一类存在于某些微生物体内能够代谢TMAO 的酶，其催化作用是将TMAO 降解为TMA[23]。TMAO 还原酶催化TMAO 还原，参与菌的呼吸产能过程，需要一系列的电子供体等组成成分 [24]，甲酸盐、细胞色素、FMN 和NADH 都可以作为TMAO 还原酶催化TMAO 还原的电子中间传递物质[25]。这种氧化三甲胺还原酶已在许多海洋细菌、淡水池塘光合细菌和肠道细菌中发现。
从鳕鱼体表和内脏混合菌群分离纯化到的菌株Y0612 通过非抑制性离子色谱分析，证明其有代谢TMAO 的能力，代谢产物为TMA，说明该菌株能够产生氧化三甲胺还原酶。通过16S rDNA 序列分析和进化树的构建及Biolog 生物鉴定法得出结论，该菌株为腐败希瓦氏菌。该菌株在有氧和无氧条件下均具有还原TMAO 的能力，对鱼肉的腐败具有促进作用。在水产品的加工中，通过SSOP 保持卫生的操作，减少与氧气的接触，对环境温度进行控制，对于该菌均有一定的抑制作用，可减少水产品的腐败。本研究为对水产品在储存加工过程中防止腐败和保持良好的鲜度，为水产加工废水恶臭控制以及对水产品内源性甲醛产生途径和机理的阐明及其有效控制提供了一定的理论依据。
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   腐败希瓦氏菌导致水产品腐败的原因探析.pdf
编辑：foodec

 
关键词： 腐败希瓦氏菌 氧化三甲胺 代谢 腐败 水产品
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